肝核因子3β (hepatocyte nuclear factor 3β, HNF 3β)作为一个重要的转录调控因子,参与哺乳动物的前肠胚和肝脏发育以及成体肝内的能量代谢,而HNF 3β在鸡(Gallus gallus)中的功能还不清楚。 肝细胞核因子(hepatocyte nuclear factor, HNF)包含HNF1、HNF2、HNF3、HNF4、HNF6和“CCAT”增强子结合蛋白,形成一个转录网络,调控肝细胞的分化,在胚胎发育和肝内代谢平衡中发挥重要作用。HNF 3β又称Forkheadbox A2 (FOXA2),是转录调控因子3家族的一员,协同HNF 3α(FOXA1)促进前肠内胚层的建立和启动肝脏的发育;HNF 3β对成年小鼠(Mus musculus)肝内葡萄糖和脂类的平衡有着重要作用;HNF 3β缺陷还会影响胚泡着床和基质细胞蜕膜化,造成完全不育。 结果表明,优化合成的Hnf 3β基因片段在大肠杆菌中实现了重组蛋白的高效表达;在6 mol/L尿素的变性条件下,Ni2+亲和层析一步法获得纯度大于95%的重组蛋白,结合快速稀释法获得了可溶性的重组蛋白HNF 3β;经重组蛋白4次免疫后,抗血清效价超过1∶64 000;免疫印迹结果显示,制备的抗体能特异性的检测出LMH细胞中HNF 3β蛋白的表达。综上所述,本研究利用制备的高纯度重组蛋白HNF3β免疫兔获得了高特异性和高效价的多克隆抗体,可以为检测鸡HNF 3β蛋白分子及研究其功能提供可靠的抗体。 这项研究根据大肠杆菌对密码子的偏爱性优化了鸡Hnf 3β基因的编码区片段序列,该优化的片段。提高了鸡HNF 3β重组蛋白在大肠杆菌中的表达,快速稀释复性蛋白的方法能有效地从包涵体中获得高纯度的可溶性HNF 3β重组蛋白;纯度95%以上的重组蛋白免疫新西兰大白兔获得了较高效价的多克隆抗体,Protein A一步法制备、纯化了HNF3β的多克隆抗体,抗体对HNF 3β蛋白具有较高的特异性和效价,可利用此抗体检测鸡HNF 3β蛋白分子及研究HNF 3β的功能。 |
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