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以往我们病理医生并不是很重视HER2免疫组化0和1+的区分，但随着HER2低表达概念的提出，临床研究显示，HER2 1+或HER2 2+、原位杂交阴性的这类HER2低表达患者对新型HER2抗体耦联药物显示出较好的效果，这就要求我们病理医生规范HER2判读，并且了解检测前、检测中、检测后哪些因素会最终影响到HER2的判读结果。 今天学习笔记内容来自杨文涛老师《乳腺癌HER2检测进展》，以及发表在中华病理学杂志上的《乳腺癌HER2低表达病理检测进展及挑战》，DOI: 10.3760/cma.j.cn112151-20220620-00542。 再次感谢老师们的无私奉献。有些老师学识渊博就已经很厉害了，长得还很好看 。还是那句老话，一系列学习笔记仅供病理医生内部使用，我不生产知识，只是知识的搬运工（侵删）。 新型HER2抗体耦联药物（antibody-drug conjugate，ADC，如Trastuzumab deruxtecan，T-DXd）Ⅰ期临床试验显示，T-DXd不仅对HER2阳性（IHC 3+及IHC 2+且原位杂交扩增）的患者有很好的疗效，对于乳腺癌HER2 IHC 1+、2+且原位杂交无扩增的患者也显示出较好的效果。
抗体偶联药物T-DXd：解决HER2低表达肿瘤异质性：既有曲妥珠单抗的作用（杀伤HER2阳性的细胞），同时可以偶联化疗药物（杀伤HER2阴性的细胞）。 
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0 无染色或≤10%的浸润癌细胞呈现不完整的微弱细胞膜染色→HER2阴性 1+ ＞10%浸润癌细胞呈现不完整的，微弱的细胞膜染色→HER2低表达 2+＞10%浸润癌中出现弱-中等强度的，完整的细胞膜染色或≤10%的浸润性癌呈现强而完整的细胞膜染色 HER2结果不确定，应进一步通过ISH方法进行HER2基因状态检测。IHC2 + / ISH +，则为HER2阳性；IHC 2+ / ISH -，则为HER2低表达。 3+ ＞10%的浸润癌细胞呈现完整、均匀的细胞膜染色→HER2阳性 国内指南已对HER2低表达做了定义：IHC 1+ 或者IHC 2+ / ISH -大部分临床研究都使用IHC 1+或IHC 2+且原位杂交（ISH）阴性作为HER2低表达定义；HER2低表达人群中IHC 1+人群占比多于IHC2+；HER2低表达有可能是激素受体阳性的患者，也有可能是三阴性的患者，在HR+中比例多于TNBC不算。HER2低表达定义里面没有强调IHC1+、ISH-，因为在质控比较理想的单位，IHC1+的患者基本上都应该是ISH-。如果IHC1+、ISH+，就是HER2阳性，我们需要核实哪里出了问题。
T-DXd在HER2低表达人群中显示出获益
T-DXd的I期数据中，T-DXd在IHC 1+和IHC2+亚组中疗效类似
大样本进一步证明，HR+ HER2低表达人群中，HER2表达状态不同亚组中的获益相似
IHC 1+或IHC 2+且原位杂交（ISH）阴性的HER2低表达患者对临床非常重要。原来0和1+不需要很好的区分因为都是HER2阴性，现在0和1+的判读也需要非常准确（因为HER2 0不是HER2低表达定义中所涵盖的，不是目前药物治疗的适宜人群），因为低表达的患者有药可用了，1+和2+的判读也需要非常准确。对绝大部分病理医生，存在判读困难的是0和1+的区别，因为1+的患者染色微弱，需要观察更仔细（高倍镜下看）。
病理医生需要非常了解哪些因素会最终影响到HER2的判读结果，检测前、检测中、检测后每一步都是需要我们特别重视的。检测前：样本取材与处理 样本取材受异质性影响 新鲜样本vs存档样本 固定时间（6-72h） 固定液选择 骨转移样本处理等 白片保存时间（推荐不超过6周） 检测中：抗体选择，质量控制 不同类型抗体，可能存在影响 染色质量 标准操作SOP 阴性与阳性对照等 染色强度与检测系统中的酶活性、反应时间、温度、底物浓度等密切相关 检测后：结果判读 0与1+判读的重视度 病理医生的判读能力 与临床医生沟通，10%微弱的膜染色，人眼判读具有主观性，不一致性。
检测前特别强调充分、及时的固定，与临床医生沟通，HER2低表达特别依赖于病理医生的准确判断，但并不是都由病理医生决定，如果临床医生有一些事情没做好的话，后续病理医生再努力也没用，包括标本及时的固定，送到病理科后我们自己的固定，包括白片切取的时间。粗针穿刺的标本，取材具有选择性，如果HER2存在异质性也会导致结果的不一致。可通过影像组学检查方法的特定参数来量化肿瘤的异质性。
在检测中环节，各个病理科的检测抗体、平台都不一样，对于这种情况，HER2低表达的判定可能存在差异，不同抗体选择出的低表达患者用药疗效是否一致，期待未来公布数据。
HER2检测结果判读不一致主要集中在0与1+。有研究显示，HER2低表达历史判读与重新判读的一致性约80%，病理医生忽略对0和1+的区分，导致判读一致性较差，但是现在我们要意识到，我们发出去的0和1+的病例，背后意味着不同的治疗。
在以往的判读标准中，有把0判为1+的，因为我们稍微看到一些膜染色，但是并没有在意比例是不是到了10%。也有1+的患者，由于膜染色微弱，未仔细观察到（未放高倍镜）而误认为无染色。现在我们要提高病理医生对0和1+判读的重视度，加强医生判读能力培训。严格按照质控指南的要求，还是可以达到临床试验的标准
HER2低表达的下限如何定义：提出HER2超低表达的概念HER2 0包括两种：一种是完全阴性（癌细胞上什么染色也没有），一种≤10%的肿瘤细胞中观察到不完整、模糊/几乎看不见的膜染色。介于0（完全阴性）到1+（稍微有一点染色）之间的叫做HER2超低表达，这些患者能否获益，证据不充分。
IHC 0中也有部分（近30%）患者能够获益，而HER2低表达的患者有37.5%获益，差距并不是特别大，提醒我们是不是HER2超低表达的患者也能从T-DXd中获益？如果能，我们病理医生只需要把HER2完全阴性的患者挑选出来就好了。但在这项研究中有一些细节是没有披露的：所谓HER2 0中有多少HER2表达介于0-1之间，而不是完全阴性，所谓HER2 0中有多少是HER2突变的。HER2超低表达是否成为领域内探索新方向，我们继续关注HER2超低表达的患者是否能从T-DXd中获益。
肿瘤间异质性：组织学类型、TNM分期都相同的乳腺癌个体采用相同的治疗方案，患者对治疗的反应和预后不一致。例：乳腺癌的分子分型，三阴性乳腺癌的再分型，HER2阳性肿瘤间异质性：Luminal-HER2（激素受体阳性），HER2-enriched（激素受体阴性），Basal HER2（表达CK5/6 CK14 EGFR等基底样角蛋白） 时间异质性：浸润癌复发转移、异时性转移性病变治疗过程中 空间异质性：同一肿瘤内的不同区域、原发灶VS同时发生转移淋巴结，同时发生的不同部位的转移灶
在粗针穿刺上就是一个HER2表达具有异质性的患者：有3+的区域，也有2+和2+达不到的区域
把其中一条放大：HER2 3+的组织占比50-60%ISH也报告了HER2基因状态+，有扩增，但是存在异质性
当免疫组化中符合HER2阳性的细胞＞10%，但存在显著异质性时，我们在报告中最好有个备注，后续发生不一致的时候我们可以一目了然，是因为异质性。HER2免疫组化报告为阳性，备注HER2状态存在异质性，报告HER2 3+细胞的百分比。 此组病例行FISH检测时需关注免疫组化中不同的HER2染色细胞群，并分别报告其扩增状态；必要时可检测多个蜡块（尤其是转移灶）以最终确定阳性细胞百分比；这组存在异质性的HER2阳性患者可以接受抗HER2靶向治疗，但需提醒临床医生此组患者肿瘤汇总还存在HER2阴性的肿瘤细胞群，有可能对治疗无反应，并导致疾病进展。
2019版ASCO/CAP关于HER2异质性的定义：HER2 FISH阳性细胞＞5%并且＜50%。HER2阳性乳腺癌存在肿瘤内基因异质性，HER2 IHC 2+和HER2基因低扩增的病例中HER2异质性更常见。HER2阳性乳腺癌中肿瘤内异质性与较差预后有关，新辅助治疗中，肿瘤内异质性与抗HER2治疗反应不良有关。
另一种情况：浸润癌中HER2 3+的肿瘤细胞＜10%1.当强而完整的细胞膜染色<10%时，免疫组化应该2.若FISH检测该病例扩增细胞数仍<10%时，本例最终HER2状态为阴性，建议进行如下备注本例HER2染色存在异质性，有小灶HER2阳性的肿瘤细胞克隆，建议可增加其他样本进行检测；如新辅助治疗前的多点穿刺活检、穿刺样本在手术后再次检测、手术样本选用其他肿瘤蜡块，转移灶蜡块由于HER2染色存在显著异质性，若出现复发转移灶，需重取活检重复检测。
当FOXC1表达非常高的时候，不太可能是一个HER2阳性
Group B: HER2/CEP17≥2.0，HER2拷贝数≥4.0，但6.0的HER2阳性患者对含有曲妥珠单抗的新辅助治疗PCR率最低。
患者基因分子分型提示基底样表型。
对于HER2拷贝数>4.0，HER2/CEP17≥2.0进一步分组3组患者新辅助治疗的pCR率有差别，但未达到统计学意义高扩增组(23%)vs其他两组(11%)：高扩增组有更好的DFS和OS(p<0.01)，可能与HER2靶向治疗效果更好相关HER2阳性中的低扩增患者可能是日后指南需特别关注的
FISH检测中，实验室间最易有分歧意见的就是HER2低扩增病例(第一组病例中HER2拷贝数<6.0)第四组和第一组中的低扩增病例的临床病理特征相似，介于第一组中HER2拷贝数>6.0和非扩增者之间对于低扩增病例且IHC非3+者(尤其是0或1+者)，建议备注 FISH结果与免疫组化结果的不一致，报告为HER2阳性，但为低扩增且免疫组化结果为阴性，此种结果罕见，其对抗HER2治疗的疗效有待于更多病例积累。建议做分子分型，因为她们可能并不是真正的HER2阳性患者。
对于HER2拷贝数≥4.0但＜6.0，HER2/CEP17≥2.0这组患者按目前指南仍属于HER2阳性，可以接受HER2靶向治疗第一代含曲妥珠单抗的临床研究中包含这组患者，但其能从HER2靶向治疗中获益的证据有限如果IHC不是2+、3+，我们更需要写一个备注，跟临床进行一些更多的沟通这组患者是否采用HER2靶向治疗需结合其他临床病理特征
同样是HER2阳性乳腺癌，我们需要逐步加深认识，对抗HER2治疗疗效有一个更好的预测。
HER2低表达肿瘤异质性更强，面临着更多的前后不一致，是其难以判读的原因之一。
HER2低表达新辅助治疗前后HER2状态的稳定性更差，新辅助治疗后标本的再次HER2检测非常重要。
肿瘤异质性影响患者预后，同时也加大了诊断难度，HER2状态诊断的临床实践中需谨慎对待，以使患者选择最合适的治疗方案，保证生存获益 病变进展过程中的分子演变(对不同病灶的活检，液体活检)，识别驱动分子事件及在疾病过程中的变化(NGS,生物信息学) 治疗耐药(靶向肿瘤微环境，肿瘤免疫治疗，不同靶向药物的联合.….… 治疗选择/靶向药物开发(创新性临床研究，篮子研究，适应性设计)
特殊染色模式：大汗腺癌、神经内分泌癌...HER2表达有时呈胞浆颗粒状染色，与3+的抗HER2治疗和低表达的抗HER2治疗都没有太大相关性（这里我没听懂）U型不完整的细胞膜染色：浸润性微乳头状癌，只要是U型染色，均一，强的，就是一个HER2 3+，ISH基本上都是扩增的，不需要说它是一个2+再做一个ISH。脱钙液的选择、脱钙时间长短、脱钙前组织是否经过充分固定乳腺癌推荐EDTA脱钙液，尤其是骨转移的标本。EDTA是温和的脱钙液，通过螯合作用脱钙，相比其他酸性脱钙液对分子生物学的影响要小很多。
常规脱钙步骤对激素受体和HER2免疫组化的影响较小，但对DNA/RNA相关检测影响较显著EDTA脱钙液对FISH以及DNA/RNA检测的影响较小强调充分固定后再脱钙：没有经过充分固定显然会对免疫组化造成影响EDTA-福尔马林结合了脱钙和固定，推荐骨转移标本至少要在福尔马林中固定1h，然后再放入EDTA脱钙/固定时间与组织大小、厚度、质地相关，但需要在6-72h
免疫组化和FISH检测主要是检测蛋白有没有表达，HER2基因有没有扩增，除此以外，HER2还可以发生突变。在乳腺癌中HER2突变率较低（2-5%），主要见于HER2非扩增的患者、转移性肿瘤如果HER2突变，可以使用TKI抑制剂（比如来那替尼）来进行治疗存在HER2突变，同时又存在HER2扩增的病理，反而会对曲妥珠单抗等治疗耐药有研究显示在HER2突变（低表达病例）的肺癌中对T-DXd是有效的，但在乳腺癌中相关数据是缺失的检测后提高判读准确性：人工智能在IHC判读中的应用：人工智能的辅助可以提高HER2低表达病例中不同医生之间的一致率 人工智能的进一步探索：AI对病理切片特征分析还能预测疗效 RT-qPCR检测HER2低表达可以更定量地评估乳腺癌样本中HER2 mRNA的表达水平，被认为是IHC/原位杂交的潜在补充或替代方法。RT-qPCR方法是否更适合HER2低表达的检测，目前还缺乏循证医学依据证实。 微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）也是一种较精确、客观的DNA扩增定量分析方法，通过对乳腺癌患者外周血中循环肿瘤DNA（ctDNA）进行检测来确定HER2状态，可动态监测患者接受抗HER2治疗时期的HER2基因的扩增情况，提供HER2基因拷贝数的实时状态、进行精准诊断。ddPCR检测与IHC和FISH检测的阳性结果一致率可达到90%~100%，通过对血液中ctDNA检测，一定程度上可以克服肿瘤异质性及时空异质性等因素，从而发现患者HER2阴性患者是否存在阴性转低表达及阳性的可能。
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