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超深渊沉积物中新的非氨氧化奇古菌门宏基因组特征 Metagenomic characterization of a novel non-ammonia-oxidizing Thaumarchaeota from hadal sediment  Article，2024-01-08，Microbiome，[IF 16.837] DOI：https:///10.1186/s40168-023-01728-2 原文链接：https://microbiomejournal./articles/10.1186/s40168-023-01728-2 第一作者：Ru-Yi Zhang（张汝毅）；Yan-Ren Wang（王彦人） 通讯作者：Zhe-Xue Quan（全哲学） 主要单位：微生物组中 复旦大学生命科学学院 - 摘要 - 背景：深渊沉积物位于超过6000米的海底，地理上是孤立的，并且处在极高的静水压下，形成了独特的生态系统。奇古菌是普遍存在于深渊环境中的海洋微生物。虽然已经有关于深渊的奇古菌的研究，其中大多数主要集中在氨氧化古菌（AOA）上。但是，还缺乏专门针对深渊异养non-AOA奇古菌的系统宏基因组学研究。 结果：在这项研究中，我们探索了挑战者深渊的深海沉积物的宏基因组，重点关注了奇古菌。基于短序列的功能分析揭示了深渊奇古菌对难降解的可溶性有机物降解的潜在贡献。通过宏基因组，组装出一种新的深海沉积物偏好的且广泛分布的非氨氧化奇古菌，被命名为Group-3.unk。对这种新型奇古菌的通路重建也支持Group-3.unk的异养特性，包括利用ABC转运通道摄取氨基酸和碳水化合物以及分解利用这些底物的代谢途径。这种奇古菌新类群还包含与一氧化碳的好氧氧化相关的基因。该类群的一个独特特征是其完整的乙醛酸循环，其为合成途径提供中间体。对属于Group-3.unk的奇古菌的基因组的泛基因组和代谢分析揭示了该菌的特征，包括与芳香化合物降解相关的二羟基邻苯二甲酸脱羧酶基因以及与AOA相比，某些类型维生素合成相关基因的缺失。值得注意的是，Group-3.unk与深海AOA共享一个特征，即其对高静水压的抗性，可能与V型ATP和二肌醇磷酸合成相关基因的存在有关。深渊沉积物中有机物的富集可能是造成在海沟沉积物宏基因组中Group-3.unk类异养奇古菌的短序列招募较多的原因。进化和基因动态分析表明，Group-3非氨氧化奇古菌由嗜中温的奇古菌有机体组成。这些结果表明Group-3.unk在non-AOA到AOA奇古菌，以及从嗜热到嗜中温的奇古菌之间的潜在作用，为奇古菌的近期进化途径提供了新的见解。 结论：通过对挑战者深渊沉积物进行的宏基因组分析，我们鉴定出了一种新的异养非氨氧化奇古菌。我们的研究深入探讨了这一新亚类异养非氨氧化奇古菌的生态学和基因组特征，从而扩展了对奇古菌演化的了解。 关键词：深渊沉积物，宏基因组，新型异养奇古菌，进化过程中的中介作用。 - 前言 - 奇古菌是地球上普遍分布的一类古生菌，其中大多数为化能自养氨氧化古菌（AOA），在全球氮循环中发挥着重要作用，特别是在海洋中[1–4]。然而，这个门也包括一些成员缺乏氨氧化关键酶的奇古菌，被归类为non-AOA奇古菌[3, 5]。与报道的属于Nitrososphaeria纲的AOA奇古菌不同，异养奇古菌在该门内分支较深[3, 7, 8]。非AOA奇古菌首次在陆地系统中被发现，如缺氧泥炭土壤[9]、地下含水层沉积物[10, 11]、地热泉[12, 13]和酸性森林土壤[5]。在海洋系统中，发现属于non-AOA奇古菌Group-3.b的psL12，具有好氧异养的特征[7, 8]。尽管海沟环境具有与深海海洋相似的环境特征（例如温度、盐度和氧气）[14–16]，但海沟的极端静水压和水文地形的使其形成了独特的生态位。海沟环境中的微生物具有嗜压、高碳周转率和独特的生态分布特征[14, 17–19]。由于漏斗效应，溶解有机物（DOM）在海沟沉积物中浓缩，导致了与海沟水域和深海平原沉积物相比，具有高细胞丰度和高微生物碳周转的微生物类群组成[19–21]。深海的主要DOM成分是难降解的溶解有机碳（RDOC），如多环芳烃和高度芳香化合物[22, 23]。通过扩增子分析，确定了奇古菌不仅在海沟水域[21, 24]中占主导地位，而且在海沟表层沉积物中也是如此[20, 25–27]。系统的宏基因组研究表明，在深海水域，尽管奇古菌是优势古菌，但氨氧化古菌（AOA）的群落组成随深度而变化[28]。与浅水中的AOA奇古菌相比，栖息在深海的奇古菌发展出了适应极端条件的新机制，例如适应高压条件的V型ATP合成酶基因[29]，用于渗透物质合成的可能的二肌醇磷酸合成酶基因[30, 31]，以及更多的有机化合物转运蛋白，用于利用沉降有机碳[28, 32]。最近，对雅浦海沟和马里亚纳海沟水域的宏基因组分析显示，AOA奇古菌在古菌中占主导地位[33, 34]。然而，在深海沉积物中，对整个奇古菌群落进行系统和详细的基因组研究仍然有限。 本研究中，通过对挑战者深渊沉积物和公共数据集的分析，我们组装出一个新的non-AOA奇古菌组的基因组。基于公共数据集的全球分布调查表明，这个名为Group-3.unk的新奇古菌类群偏好栖息在深渊沉积物，同时也普遍分布于海洋、陆地和极端环境中。泛基因组分析进一步揭示了导致这种新异养奇古菌具备特殊生态位的因素。此外，还进行了进化和基因动态分析，为了解奇古菌的分化提供新见解。 - 结果与讨论 - 1. 参与DOM降解的优势奇古菌 马里亚纳海沟挑战者深处0到10厘米深度沉积物样本中，细菌中的变形菌门和古菌中的奇古菌的占优势（图S1）。宏基因组学分析显示，马里亚纳海沟沉积物的微生物群落在DOM降解相关途径中具有很高的代谢权重（MW分数，表示功能基因覆盖）（图1A）。排名前三的DOM降解途径分别是氨基酸氧化（MW分数=10.1）、发酵（MW分数=9.6）和乙酸氧化（MW分数=9.3），其中奇古菌分别贡献了23.7%、24.9%和25.6%的MW分数。此外，微生物群落在芳香物质降解相关基因覆盖（MW分数=5.6）方面也有很大的贡献，其中奇古菌是主要的贡献者，占MW分数的42.6%。这些途径的主要酶的详细信息见表S3。 由于芳香物质的生物反应性较低[70]，它们构成了深海DOM的一个重要部分，被认为是RDOC的关键组成部分[22]。奇古菌对RDOC降解相关基因的贡献大量贡献（表S3），包括黄素戊二烯基转移酶（UbiX）[71]，表明奇古菌可能在有限的DOM条件下具有代谢RDOC及其中间体的潜力。功能网络显示了奇古菌上（图1B）有机物降解（如芳香物质降解、乙酸氧化和发酵）与无机物氧化（如氨氧化和硫化物氧化）之间的高频连接（最高的节点度）。这表明在海沟沉积物表面，微生物有机物降解与无机物氧化之间存在生态连接，并在奇古菌的促进下进行。 之前的宏基因组和转录组研究发现，在挑战者深渊沉积物中，涉及乙酸和芳香物质降解的基因和转录本的相对丰度很高[34]。然而，高表达的相应代谢基因的具体贡献者仍然不清楚。因此，通过对Ying等人[34]的这些次级转录组数据的重新分析，我们发现奇古菌对芳香物质降解的转录本贡献了23.3%，对乙酸氧化的转录本贡献了11.0%，对发酵的转录本贡献了10.4%（表S4），进一步表明其在DOM降解中的重要作用。因此，除了氨氧化外，奇古菌（包括下文描述的主导奇古菌AOA）还在挑战者深渊沉积物中占据异养生物降解DOM的生态位。 为了更好地探索细胞功能潜力，我们从通过从头组装策获得了60个高质量的去冗余的MAGs（表S5）。从0-2厘米深度（bin MT1_thaum1）和7-8厘米深度（bin MT7_thaum2）沉积物的组装结果中获得的两个奇古菌基因组草图。基于MT1样本的宏基因组中的contig序列覆盖度，确定了来自奇古菌MT7_thaum是最丰富的微生物之一（图S2），这进一步确认了奇古菌在挑战者深渊沉积物中的古菌主导地位。  图1 基于宏基因组短序列的代谢分析 (A) 每个功能的代谢权重（MW）分数是使用METABOLIC软件[48]计算的，该软件指示整个群落内的功能权重。对每个MW分数的贡献百分比反映了每个门对整个群落内功能的贡献。奇古菌对氨氧化、芳香降解、硫化物氧化、醋酸盐氧化和氨基酸利用的MW分数表现出很高的百分比贡献。这些途径的主要酶的详细信息见表S3。 (B) 节点度表示与每个节点的连接数。给定边的粗细反应两个生物地球化学循环步骤的平均基因覆盖度。 2. 奇古菌的系统发育分析 MT7_thaum2与前期研究中从马里亚纳海沟深度为8000米的水样中获得的Candidatus_Nitrosopumilus_sp_MTA1具有高相似性（ANI值为0.97）（图S3）。进行了两个Bathyarchaeota、5个Aigarchaeota和85个Thaumarchaeota（表S6）的系统发育分析，以提供有力的Thaumarchaeota系统发育树（图2）。从公共宏基因组数据集中重建的MT1_thaum1和其他四个相关的MAGs（ANI值>0.82，与内部比较）与Group-3有关，但不属于Group-3.a/b（ANI值<0.73）（图S3）；与UBA141 [72]相比具有相对较长的系统发育距离。基于这一模式，我们提议其为奇古菌non-AOA的一个新亚族，命名为Group-3.unk。 迄今为止，在深海水域或沉积物中尚未进行广泛的异养奇古菌基因组和转录组研究。我们的结果表明，祖先奇古菌的出现后，它们分化成三个主要的非AOA谱系，具有独特的栖息地：Group-1，热泉；Group-2，厌氧土壤；Group-3.a，土壤环境；以及Group-3.b（psL 12），海洋水域。然而，除了本研究中分析的沉积物，Group-3.unk的完整生态位尚不清楚。  图2 本研究中组装和分箱得到的奇古菌的系统发育树 树中包括两个Bathyarchaeota、五个Aigarchaeota和85个Thaumarchaeota基因组（51个氨氧化古菌[AOA]和34个non-AOA），其中有两个MAGs是在沉积物中组装的，另外四个是从公共数据库中组装得到。系统发育树分析基于122个古菌保守基因的串联比对，采用IQ-TREE进行树的构建，进行了1000次bootstrap重新取样。图例显示了分类隶属和基因组的环境来源。在[50-70]和[70,100]范围内的bootstrap值的节点分别显示为灰点和黑点。折叠的类群表示外类群。 3. Group-3.unk奇古菌的广泛分布 Group-3.unk奇古菌的全球分布评估表明，这一群体分布于多样的环境中，包括陆地、海洋，甚至极端环境（如深海水域和沉积物、温泉和热液口）。尽管在某些土壤和沉积物样品中，Group-3.unk奇古菌占据了整个奇古菌门的比例（图3A），但Group-3.unk在大多数样品中显示了相对较低的基因组绝对数量，根据低的RPKG值（<0.1）（表S7），这可以解释为什么这些基因组在先前的研究中未被拼接到。然而，在深度超过6000米的样品中，Group-3.unk的一些RPKG值达到了>30（图3B，表S8），这表明这一群体对深海环境有特定的生态位偏好。 海沟环境被认为是有机物的沉积中心，相对于海洋上层而言，其富营养程度较低；在这些环境中，有机物的沉降被认为是生产的驱动因素[14, 73]，其中RDOC随着深度的增加而增加[22]。为了适应海沟环境的独特条件，比如富含RDOC和高静水压，Group-3.unk可能发展出适应高和有机异养的能力，比如于最近报道的Group-3.b [7, 8]，即Group-3.unk的姐妹群，就具备这样的特性。  图3 不同类群 Thaumarchaeota 的全球分布 (A) 234 个Sequence Read Archive（SRA）数据集中Thaumarchaeota的调查。地图上显示了Group-3.unk绝对丰度排名靠前的样本。去除了重叠的点，只显示了代表性样本。Group-3.unk non-AOA在多类型的样本中普遍分布。 (B) 不同类群Thaumarchaeota的丰度和深度之间的关系，以每千碱基组基因组每十亿碱基（recruited per kilobase of genome per gigabase, RPKG）表示各类群的绝对丰度。 4. Group‑3.unk分支的潜在特征 重新构建的代谢途径表明，non-AOA Thaumarchaeota Group-3.unk能够进行异养代谢。Group-3.unk基因组编码有转运胞外有机质的转运通道基因，这些通道将细胞外的氨基酸和碳水化合物转运到细胞质内，并通过中心碳代谢进行利用。FlaI/J/F/H基因是古菌鞭毛生物合成的关键基因，表明其具有运动潜力。此外，该分支还具备通过转运胞外氨基酸补充三羧酸循环（TCA）的中间产物、糖异生储存碳源以及绕过TCA循环中两个二氧化碳分子的排放，通过乙醛酸循环促进碳回补反应，为Group-3.unk适应极端环境提供了可能（图4）。  图4 五个非氨氧化奇古菌 Group-3.unk基因组的代谢通路示意 五个彩色点表示本研究中的MAGs，顺序为MT1_thaum1、SRR10168429_blastn_bin_1、SRR12157856_bin_58、SRR14708362_bin_10和SRR14708957_bin_13。糖酵解/糖异生、完整的三羧酸循环和半乳糖降解显示为不同的背景。氨基酸代谢和应激响应信息显示在黑色方框中。 转运通道 注释出多种能够吸收有机底物的转运通道，如氨基酸和二肽/寡肽（图4）。所有五个Group-3.unk 基因组都拥有对谷氨酰胺、谷氨酸或天冬氨酸的转运蛋白，这些底物可以转化为富马酸和2-酮戊二酸，是TCA循环的中间产物（图4）。此外，所有基因组都还拥有可能吸收糖、巨环酸和甘油的ATP-binding cassette（ABC）超级家族转运蛋白。有关这五个Group-3.unk基因组的转运蛋白的详细注释信息，请参见表S9。尽管AOA的混合营养或异养性质缺乏明确的验证，但之前已经报道了在异养性non-AOA海洋古菌[8]和自养性AOA Thaumarchaeota [74]中存在简单寡糖和单糖、氨基酸和甘油的ABC转运蛋白的潜在基因。ABC转运蛋白的表达，尤其是氨基酸转运蛋白，在海洋深层增加[76]。值得注意的是，在海沟中的AOA Thaumarchaeota成员中，识别到的转运蛋白基因比那些生活在海洋上层的成员中更多[28]。Group-3.unk中高比例的有机物代谢相关的arCOG也支持该组在有机代谢方面具有很大的潜力（图S4）。这意味着氨基酸和碳氢化合物的转运蛋白可能有助于Group-3.unk微生物适应深海环境。 马里亚纳海沟的挑战者深渊是地球上最深的地方，其DOM主要由RDOC组成[22]。适应这个极端环境可能有利于存在多种转运蛋白。此外，还观察到了铁离子转运蛋白和液泡铁转运蛋白（VIT）同源物。已知VIT在存储铁和调节铁的稳态过程中起着重要作用，以避免过量的铁积累可能导致细胞毒性[77]。从细胞外环境中吸收铁离子并积累，有助于铁元素作为酶辅因子的细胞活动。Group-3.unk基因组拥有编码多糖输出的基因（表S9），还注释了一些多糖合成相关基因（表S10），表明它们可能具有类似于Nitrososphaera viennensis [78]和Candidatus Nitrosocosmicus agrestis [79]的胞外多糖生产的潜力。 中心碳代谢 Group-3.unk的基因组拥有一个几乎完整的糖酵解途径，除了缺少磷酸果糖激酶，这可能是由于组装空缺引起的。利用完整的糖异生途径，Group-3.unk可以将苹果酸转化为葡萄糖6-磷酸。此外，所有的基因组都拥有用于碳回补反应的乙醛酸循环，这进一步突显了Group-3.unk在Thaumarchaeota中的代谢多功能性。大多数AOA Thaumarchaeota通过3-羟基丙酸/4-羟基丁酸途径固定碳[80]，而大多数非AOA成员可能利用核糖醇-1,5-二磷酸羧化酶[7, 8]或Wood–Ljungdahl途径进行碳固定[11]；然而，所有这些碳固定途径的关键基因在Group-3.unk中都缺失，只有不完整的可逆TCA循环。Group-3.unk中所有五个bins的中心碳代谢基因的注释见表S10。 能量代谢 Group-3.unk拥有一个呼吸电子传递链，其中包括编码细胞色素c氧化酶的一部分的基因簇（表S10），表明其使用氧气作为电子受体。Group-3.unk的大多数MAGs包含完整的V型ATP合成酶基因簇（表S10），用于适应高压条件，与深海AOA相同[29]。此外，有好氧一氧化碳脱氢酶（CODH）复合物（CoxLMS）的大、中和小亚基的存在，表明Group-3.unk可能在好氧条件下利用一氧化碳[13, 81]。系统发育分析显示，Group-3.unk的CoxL可以归类为Form II CODH [82]，具有功能性基序（PYRG AGR）（图S5），与Aigarchaeota JZ_bin19相比，相似度最大为46% [13]。Form II CODH的CO氧化功能在好氧高温古菌Aeropyrum pernix TB5中已经得到实验证实[83]。由于一些仅具有form II coxL的MRC（Marine Roseobacter Clade）菌株据已知情况无法氧化CO [84]，因此需要进一步研究以确认Form II CODH是否参与non-AOA Thaumarchaeota的CO氧化功能。 据报道，水下热液活动[85, 86]和广泛存在的海洋细菌[85, 87]会产生CO。尽管到目前为止尚无关于海沟生态系统中CO产生的报道，但不同深海的宏基因组中发现了高丰度的CODH基因[85, 87]。因此，CO可能对Group-3.unk在深海海底沉积物中的生存至关重要。 5. 比较基因组揭示功能差异 如上所述的分布分析和代谢通路重建表明，Group-3.unk可能具有适应深海环境的能力。事实上，全基因组和代谢分析表明Group-3.unk Thaumarchaeota既具有独特的特征，又具有与其他Thaumarchaeota群体的共同特征（图5）。 在维生素合成上non-AOA和AOA Thaumarchaeota表现出明显的差异。仅在AOA群体中发现VB1（硫胺素）、VB7（生物素）和VB12（钴胺素）的生物合成模块，这与先前的研究结果一致[6, 88]。然而，在我们分析的所有non-AOA群体中，包括Group-3.unk，没有发现完整的与维生素合成相关的途径；然而，non-AOA Thaumarchaeota携带了编码对外源维生素进行摄取的转运蛋白的基因。Non-AOA中存在的硫胺素转运系统可以弥补VB1合成缺陷。此外，几乎所有non-AOA Thaumarchaeota都具有ABC转运通道（例如EcfT），负责从环境中摄取微量营养素，比如维生素[89–91]。 微生物采用氧敏感的丙酮酸-电子载体氧化还原酶（POR）[92, 93]和好氧丙酮酸脱氢酶（PDH）将丙酮酸转化为乙酰辅酶A。在本研究中，大多数AOA和non-AOA Thaumarchaeota的多聚体（OforAB）[94, 95]中发现了取代PDH [96]的2-氧酸-电子载体氧化还原酶的亚基（OforAB）（图5）。AOA Thaumarchaeota的多聚体几乎完全丧失了PorABCD和PDH复合物（PdhD和AceE）。Group-3.b和Group-3.unk成员也不含POR，与先前关于氧化non-AOA成员缺失POR编码基因的研究结果一致[6, 88]。与脂肪酸合酶(LipAB)相关的基因，它是丙酮酸脱氢酶(PDH)和有氧代谢的重要辅酶[97]，它在多数基因组中和编码PdhA的基因同时出现（图5）。一些厌氧呼吸的non-AOA Thaumarchaeota（Group-2的YP1_bin3和Fn1）同时包含POR和OFOR（图5），这可能是由于缺乏终端氧化酶导致的[9]。预测从non-AOA到AOA Thaumarchaeota的演化过程中，大约在23亿年前的大氧化事件中[88]，与厌氧能量生产相关基因的发生了丢失，因此，本研究描述的现象可能表明好氧的non-AOA Thaumarchaeota逐渐失去了厌氧生长的能力，通过从厌氧（或兼性）的non-AOA到好氧的non-AOA最终成为好氧的AOA。 泛基因组分析显示，从马里亚纳海沟沉积物中拼接出的non-AOA和AOA MAGs独特地拥有参与渗透调节相关的编码肌醇-1-磷酸胞苷基转移酶/二肌醇-1,3'-磷酸-1'-磷酸合成酶（IPCT/ DIPPS）的基因（图5），该基因参与二肌醇磷酸的生物合成，这是一种关键的渗透保护物，先前在许多超嗜热古菌和细菌中发现[30, 31]。有报道称，从深海水中拼接出的MGI类群深海AOA独特地携带IPCT/DIPPS基因以应对高水压[32]。马里亚纳海沟的一项最新研究通过反转录qPCR鉴定了IPCT/DIPPS基因的表达，并仅在深海样品（> 4000 m）中检测到IPCT/DIPPS的表达，进一步强调了IPCT/DIPPS对抵御高水压的要求[28]。有趣的是，通过比较基因组分析（图5，表S11），发现IPCT/DIPPS基因仅在Group-3.unk和AOA中检测到，而在从其他环境分选出的所有其他Thaumarchaeota成员中均不存在。这表明IPCT/DIPPS可能有助于AOA和non-AOA Thaumarchaeota适应极端的水压。 此外，Group-3.unk特异的地拥有二羟基邻苯二甲酸脱羧酶（Pht5）（图5），该酶在多环芳烃的降解中发挥作用，将4-羟基邻苯二甲酸转化为3-羟基苯甲酸或4,5-二羟基邻苯二甲酸转化为3,4-二羟基苯甲酸[98]。此外，Group-3.unk中的所有MAGs都包含编码间苯二酚2,3-双加氧酶（CatE）的基因，该酶通过打开苯环的环来将间苯二酚转化为2-羟基琥珀酸-6-半甲醛。这进一步支持了Group-3.unk在深海沉积物中对芳香族RDOC的降解特性。  图5 non-AOA和AOA群体之间的比较泛基因组结果 MT1_thaum1和MT7_thaum2是从马里亚纳海沟沉积物样本中组装的元基因组（MAGs）。SRR12157856_bin_58、SRR10168429_blastn_bin_1、SRR14708957_bin_13和 SRR14708362_bin_10是从公共SRA数据集中重新组装的。本研究中 Group-3.unk的所有MAGs都是non-AOA，而MT7_thaum2属于AOA群体。显示了参与硫胺素合成、生物素合成、钴胺素合成、丙酮酸氧化、硫辅酶酸合成和芳香族降解的基因。PdhAD，丙酮酸脱氢酶E1亚基 alpha/二氢脂酰脱氢酶；AceE，丙酮酸脱氢酶E2亚基；PorABCD，丙酮酸脱氢酶α/β/γ/δ亚基；OforAB，2-氧代戊二酸/2-氧代酸铁氧还蛋白氧化还原酶α/β亚基；LipAB，脂酰合成酶AB；CatE，邻苯二酚2,3-双加氧酶；UbiX，黄素前体转移酶；Pht5，4,5-二羟基苯甲酸脱羧酶；EcfT，能量偶联因子运输系统渗透蛋白；CoxL，好氧一氧化碳脱氢酶大亚基；IPCT/DIPPS，肌醇-1-磷酸胞苷基转移酶/双肌醇-1,3'-磷酸-1'-磷酸合成酶。 6. 从嗜热到温和non-AOA奇古菌的基因动态 基因的获得和丢失事件在一定程度上可以用来推断原核生物的环境适应进化过程[99]。因此，我们基于81个选定基因组的同源蛋白基因家族对Thaumarchaeota和Aigarchaeota基因组的动态和祖先重建进行了分析。Aigarchaeota和Thaumarchaeota形成一个单系群，它们的共同祖先展现出2576个同源基因家族（图6A中的节点1和表S12），其中既包括编码反硝化酶（COG0243和COG4263）和丙酮酸形成的关键厌氧酶（COG0674，COG1013和COG1144），还包括终末氧化酶，包括血红素-铜细胞色素c氧化酶（COG1622，COG1845和arCOG08921）和细胞色素bd泛醌氧化酶（COG1271）。这意味着Aigarchaeota和Thaumarchaeota的共同祖先可能具有一种兼性厌氧生活方式。在共同祖先中检测到一种NiFe-Group 3a氢化酶（COG1035）和参与四氢甲基四氢叶酸依赖的Wood–Ljungdahl途径的酶（COG1152，COG1880，COG1614，COG2069，COG1456）[11，100]。富含H2的热环境[101]与Wood–Ljungdahl途径[102]的协同作用与这一共同祖先的热栖息地相一致。基于同源基因总数的主坐标分析（图S6A）显示，non-AOA Group-1.a/b/c的基因组与Aigarchaeota聚集在一起。考虑到non-AOA Group-1和Aigarchaeota的栖息地，这些结果表明了Group-1 Thaumarchaeota和Aigarchaeota之间在微生物生态位和功能上的相似性[13]。相较于其他Thaumarchaota群体（< 42 ºC，除两个热带AOA（ThAOA）基因组外），高于57 ºC的预测最适生长温度（OGT）Group-1 Thaumarchaeota和Aigarchaeota（图S7）也支持Thaumarchaota从嗜热到嗜中性的演变。 进一步的时间估算分析显示，OGT的转变与这些群体及相应地质事件的分化时间是良好对应的（图6B）。具体而言，表现出温带生态位的Group-2（844 Ma，95% CI 1369–521 Ma）和Group-3.a（799 Ma，95% CI 1417–450 Ma）起源于约800 Ma。这个时间范围与Sturtian“雪球”冰川时期（717–659 Ma）[103]和大型玄武岩区域开始的时期（825–755 Ma）相一致——这个时期被称为“火与冰”[104]。这个同时期不仅由于冰川作用而表现出广泛的温度梯度[105]，而且伴随着强烈的岩浆活动，促使了极端耐热古菌向广泛的温度生态位的转变。这个观点与先前研究的结果[67]一致，并与AOA内的嗜中温的陆地类群的出现相符（Group I.1b—本文中的Nitrososphaerales：657 Ma，95% CI 849–496 Ma）。这种观察到的模式还表明了Thaumarchaeota从恶劣环境（热环境中的Group-1 Thaumarchaeota）到温和栖息地（陆地和海洋生态系统中的Group-2和Group-3 Thaumarchaeota）的平行适应轨迹。 在Group-3 Thaumarchaeota演化过程中（从节点12到节点13）出现的大量基因丢失与少量基因增益事件（图S6B）表明了基因流失或基因减少的现象[106]。从non-AOA到AOA的关键节点（节点12到节点28；图S6B和表S12），编码参与氨氧化和维生素合成的酶的基因获得与比较基因组分析的结果（图5）和先前的研究[6, 13, 88, 107]相似。此外，Group-3.a中与有机质代谢相关arCOGs的基因比例较低，与AOA群体中的模式相似（图S7）。然而，其他群体显示出与AOA和Group-3.a相比等量的有机代谢相关arCOGs的数量，且高于AOA和Group-3.a。有机代谢潜力进一步支持Group-3.unk的异养能力，并推测Group-3是从non-AOA到AOA Thaumarchaeota转变的关键节点。研究更多Group-3 Thaumarchaeota相关的基因组将扩展我们对Thaumarcheota进化的理解。  图6 古菌演化分析 (A) Thaumarchaeota中同源基因家族的动态演化。使用COUNT进行的祖代基因组内容重建。在树的每个分支上标有预测祖代基因组中存在的基因数量以及基因获得和丢失事件。节点右侧的数字表示预测现存基因的数量。“+”表示基因获得事件，“–”表示基因丢失事件。拓扑树是基于来自81个高质量基因组（完整度 > 80%）的122个古菌保守基因的串联比对构建的。氨氧化古菌（AOA）中的Nitrosocaldales、Nitrosophaerales和Nitrosopumilales以及Aigarchaeota都已经折叠。 (B) Thaumarchaeota关键节点之间的时序估算分析及其在整个地球历史的地质时间尺度。树中加入了21个广古菌门、16个泉古细菌门、一个初古核菌门、两个深古菌门和两个DPANN古菌门的基因组（作为外类群）。Thaumarchaeota基因组与图6A中相同。完整的树见图S8。在 boostrap（70-100）和（50-80）范围内的节点显示为灰点；在（70-100）和（80-100）范围内的节点显示为黑点。底部的时间单位是百万年（Ma），对应的地质时期置于顶部面板中的。 - 材料和方法 - 1. 马里亚纳海沟沉积物采样和宏基因组测序 从2016年12月到2017年1月，利用MV张建号在马里亚纳海沟的挑战者深渊（11.4037°N，142.3630°E，深10,853米）进行了0到10厘米深度的沉积物采样。使用搭载有箱式取样器的深海着陆器[35]采集了一个沉积柱。详细的样品制备和宏基因组文库构建过程按照先前的研究描述进行[25, 36]。原始数据已存储在国家生物技术信息中心（NCBI）数据库中，可在项目ID PRJNA692099[36]下访问。 2. 组装、分箱、分类和系统发育分析 数据集的处理方式如下。使用Fastqc（https://www.bioinformatics./projects/fastqc/）检查的测序结果质量。使用Trimmomatic（v0.39）[37]去除低质量序列和测序接头，参数ILLUMINACLIP:2:30:10:2 LEADING:3 TRAILING:3 MINLEN:36。只有成对的高质量序列用于组装。从不同深度采集的沉积物数据分别使用组装工具SPAdes（v3.13.0）[38]在meta模式下组装，得到了九个scaffold文件。各样本的干净序列通过Burrows-Wheeler Aligner [39]以MEM模式映射到相应的scaffold文件。使用MetaBAT2 [40]单独对九个scaffold文件进行分箱。通过DAS_Tools [41]进一步提炼九个样本的bins，并使用CheckM [42]进行评估。合并来自各自组装的高质量MAGs（完整度≥70%，污染度≤5%），使用dRep（v2.6.2）[43]进行去冗余，然后使用GTDB-Tk（v1.3.0）[44]对MAGs进行分类。选择GTDB-Tk基因组分类的中间文件奇古菌的122个古菌标记基因的多序列比对文件用于重建系统发育树。系统发育树使用IQ-TREE（v2.1.2）[45]在PROTGAMMALG模式下构建，使用1000次bootstrap值计算。使用在线工具iTOL [46]对系统发育树进行可视化。使用pyANI（v0.2.10）[47]计算平均核酸同源性（ANI）值。考虑到缺乏氨氧化酶基因（amoA）[7–9, 12, 13]的非AOA奇古菌的不同环境来源和代谢特征，基于先前的系统发育和泛基因组研究对它们进行聚类分组[6, 8]。 3. 以宏基因组短序列为基础的群落组成和代谢覆盖度分析 对去重的MAGs使用CoverM（0.6.1） (https://github.com/wwood/CoverM)，采用"contig"命令和以下参数：methods, trimmed_mean; min-read-percent-identity, 95; min-read-aligned-percent, 75。计算了每个contig的覆盖度，并通过长度对每个MAG的覆盖度进行了归一化。在每个宏基因组样本中，MAG的相对丰度被计算为覆盖度除以去重MAGs数据集中所有基因组的总覆盖度。使用GTDB-Tk的classify_wf命令对去重的MAG数据集进行分类。使用METABOLIC（v4.0）来量化微生物组、微生物代谢的传递和交换以及功能网络的重建[48]。 4. 注释和通路构建 使用Prodigal（v2.6.2）[49]在meta模式下预测编码序列和翻译蛋白。基于KEGG数据库结合本地注释工具KofamScan（v1.3.0）[50]，使用默认参数对基因组进行注释。KofamScan的注释结果被提交到KEGG [51]进行通路构建。随后，使用InterProScan（v5.38–76.0）[52]和EggNOG-mapper（v2.1.5）[53]完成注释。使用不同软件的不同注释结果的基因在UniProt [54]中通过BlastP（e值为10^−5）与UniProtKB参考蛋白质组和Swiss-Prot数据库手动矫正，选择最佳结果作为最终注释结果。转运通道的注释在TransportDB 2.0 [55]中进行，并在Transporter Classification Database [56]中使用默认参数进行矫正。 5. 泛基因组、功能和代谢比较分析 在本研究中鉴定的奇古菌MAGs和参考基因组被提交到一种组学数据分析和可视化平台（anvi'o，v7.0）[57]，进行泛基因组、功能和代谢比较分析。从公共数据库和本研究中选择了完整度大于70%且污染度小于5%的奇古菌基因组，根据微生物泛基因组学和代谢工作流进行详细的比较基因组分析。基于KEGG概要数据库，使用anvi-run-kegg-kofams对基因进行注释。使用脚本anvi-pan-genome进行泛基因组分析。使用BlastP进行氨基酸序列相似性计算，使用Markov cluster算法 [58]根据氨基酸序列相似性进行基因簇识别。对于Thaumarchaeota门的高级分类，使用软参数（minbit = 0.5和mcl-inflation = 2）用于远缘相关的基因组分析。使用脚本anvi-compute-functional-enrichment进行功能富集分析。比较基因组分析结果由ggtree [59]可视化。通过BlastP针对定制的参考数据库和功能注释结果，确认了CoxL，一种好氧一氧化碳脱氢酶（CODH）的一个亚基的蛋白质序列，并选择具有活性位点motif的CoxL序列进行进一步的系统发育分析[13, 60]。 6. 非AOA奇古菌的全球分布 使用先前研究中描述的序列招募方法[61]估算了non-AOA奇古菌的全球分布。总共从NCBI SRA数据库下载了来自各种样本类型的234个SRA序列数据集。为了避免核糖体RNA（rRNA）基因对丰度估算精度的干扰，使用Barrnap（v0.9） (https://github.com/tseemann/barrnap/)预测了基因组的rRNA基因。使用Bedtools（v2.27.1）[62]的maskFastaFromBed命令用于屏蔽基因组的rRNA序列。使用BLASTn进行读取招募，并基于50 bp的长度、95%的相似性和10^−5的e值进行过滤。这些序列用于在物种水平上识别大致相似的基因组[63]。合格的hits用于计算奇古菌在每个SRA中每千碱基基因组每十亿碱基的读取计数（RPKG），反映了标准化的奇古菌丰度，使其能够在不同的基因组和metagenome之间进行比较。 7. Group-3.unk类群基因组的重建 用于重建Group-3.unk的数据从SRA数据集中获取，这些SRA数据与Thaumarchaeota基因组的全球分布分析中的数据保持一致。根据从海沟沉积物中分箱的MT1_thaum1的分布和丰度，选择了丰度排在前14个候选SRA数据集进行MAG的重建。按照上述描述的步骤进行行单独的从头组装和分箱。值得注意的是，对于SRR10168429，从原始单个组装中获得的类似MT1_thaum1的MAG完整性较低。因此，MT1_thaum1基因组被用作参考，使用BLASTn招募了SRR10168429中的短序列，再进行从头组装。 8. 基因动态、最适生长温度（OGT）预测、时序估算和有机代谢潜力 为了更好地了解奇古菌的演化历史并避免由基因组不完整引入的偏差，对完整度>80%且污染度<10%的81个基因组进行了进一步的演化分析。如上述所述，构建了一个系统发育树。为了深入了解奇古菌基因组的演化，将过滤后的蛋白序列输入到OrthoFinder（v2.5.2）[64]中，使用默认参数，除了“-M msa”，并获取了同源基因家族。使用EggNOG-mapper对这些基因家族进行注释和分类。除了这些基因组中这些基因家族的矩阵外，我们使用COUNT程序[65]使用默认参数和gain–loss-duplication模型及后验概率推断遗传事件（存在、获得和丢失）。为了评估奇古菌门的演化历史，确定了其共同祖先，同源基于家族的获得、丢失和出现事件在COUNT程序中通过birth-and-death模型以及Dollo的最简法[65]对每个演化节点和分支进行预测。高质量的基因组的OGT预测使用Tome工具 [66]进行。此部分分析还包括了45个额外的古菌基因组[67]，这些基因组与本研究中获得的高质量基因组集一起用于演化分析，并用于计算奇古菌门演化历史中的关键发生时间（表S1）。构建系统发育树的方法与上述描述的方法相同。随后，通过Reltime [68, 69]对系统发育树进行了时间线分析，以DPANN古菌为外类群，并选择了六个古菌化石场景作为校准。AOA奇古菌的估算结果与先前研究的发现一致[67]（表S2），证明了此时序估算分析的可靠性。有机代谢潜力通过有机代谢相关的古菌同源基因簇（arCOG）占所有注释基因的比例来确定。 - 总结 - 总体而言，这项研究揭示了在马里亚纳海沟挑战者深处沉积物中最丰富的古菌—奇古菌门（Thaumarchaeota）的功能贡献和系统发育多样性。考虑到与有机物降解相关的基因的显著占比，挑战者深渊沉积物中的奇古菌门可能在生态学上具有重要意义。全球分布分析揭示了Group-3.unk的普遍分布及其对生存于深海环境的偏好。此外，比较基因组分析揭示，所有分离的Group-3.unk古菌门都具有对一氧化碳进行好氧氧化的潜力。IPCT/DIPPS基因似乎是奇古菌适应极端高静水压的关键基因，不仅在之前报道的深海AOA中出现，而且在挑战者深处沉积物中发现的non-AOA古菌门中也出现，而在非深海的奇古菌中则不存在。演化分析揭示了奇古菌从嗜热到嗜中温的进化过程。作为AOA的最近的单系群，Group-3 non-AOA是理解AOA进化的关键类群。 因此，本研究揭示了一种在深海生境中具有独特生态位和生存偏好的新型non-AOA奇古菌，拓展了我们对挑战者深渊奇古菌的了解。为了支持这个新型异养的non-AOA奇古菌的基因组学、生态学和进化特征，还需要更多有关这个类群的培养物和基因组信息。 参考文献 Zhang, RY., Wang, YR., Liu, RL. et al. Metagenomic characterization of a novel non-ammonia-oxidizing Thaumarchaeota from hadal sediment. Microbiome 12, 7 (2024). https:///10.1186/s40168-023-01728-2 - 作者简介 - 第一作者 复旦大学 生命科学学院 张汝毅 生物系博士研究生 主要进行有关环境微生物组以及人体微生物组的研究，目前以第一作者和共同一作的身份在Microbiome、mSystems、BMC microbiology等期刊发表文章。 香港大学 土木工程系 王彦人 在读博士研究生 现关注环境微生物的基因组组装、系统发育进化、水平基因转移以及抗生素抗性基因分布等方面。目前以第一/共一作者在Microbiome、Microbiology Spectrum期刊发表文章共2篇。 通讯作者 复旦大学 生命科学学院 全哲学 教授 全哲学，复旦大学生命科学学院教授。1997年获北京大学化学系学士学位，1997年至2005年在韩国科学技术院(KAIST)攻读硕士和博士。2005年回复旦大学生命科学学院担任讲师、副教授和教授。国家自然科学基金委重大研究项目“水圈微生物驱动地球元素循环的机制”专家组学术秘书。Journal of Microbiology，Microorganisms和PLoS ONE编委。鉴定命名了细菌1个新纲(Class)和厌氧氨氧化菌(Anammox)的第5个候选属。开发了基于宏转录组的不依赖于“通用”引物的微生物群落结构分析方法，并基于高简并引物的两步PCR方法，发现全程硝化菌(Comammox)的广泛分布，并正对此开展富集培养实验。 |
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