|
 
Nature杂志：2023年，超过1万篇SCI高级论文撤搞。 网址：https://pubmed.ncbi.nlm./38087103/ 
中国作者撤稿占到所有SCI论文撤稿的49.86%！ 中国撤稿率23.5%。 无言！ 细胞周期：G0（脱离细胞周期暂时停止分裂的一个阶段）→G1（DNA合成前期）→S（synthesis，DNA合成期）→G2（DNA合成后期）→M（mitosis，有丝分裂期）。流式细胞仪检测细胞周期时，一般地，假设G0/G1期细胞荧光强度设定为1，正处于DNA复制的S期细胞荧光强度在1~2之间，而G2/M期则存在双份基因组其细胞荧光强度约为2。流式细胞仪分析的细胞周期一般分为G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋亡峰(也称sub-G0期)。 
按照厂家提供的试剂盒说明书操作，即可，每个厂家的试剂，操作方法略有不同。 比如，四正柏生物。 
细胞收集：很多文献建议收集处于生长对数期的细胞。根据具体的试验调节。细胞计数：很多试剂，一份试剂只能染色10万到100万个细胞，所以，最好计数一下细胞，多了试剂就搞不定。
由于流式细胞仪分析的是单个细胞，因此在操作过程中需充分混悬细胞。充分消化细胞，但是又不能过度消化。也不可过度吹打细胞，以防产生过多的细胞碎片（分析的是单个细胞）。单个细胞：如果细胞过多或聚团较多，为了避免堵住仪器管路，上机前，可先用300目（孔径40~50微米）尼龙网过滤，然后再上机检测。细胞固定：一般需要用70%~75%乙醇固定细胞，让细胞膜具有通透性。因为PI等染料不能透过完整的细胞膜，固定细胞，让细胞膜具有通透性，染料才能进入细胞。尽量不要直接用70%~75%乙醇固定细胞，70~75%乙醇很容易导致细胞聚团，很难重悬成单细胞，影响固定效果。要先用冷的PBS重悬分散细胞，然后滴入（不是快速打进去，是滴进去）高浓度（比如95%~100%）的乙醇，让最终浓度为70%~75%。细胞染色：用染色剂，染色细胞，然后流式细胞仪才能检测。细胞凋亡，一般要两种试剂染色；细胞周期，才需要一种染色剂。
碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）：DNA结合染料，检测坏死细胞或凋亡晚期细胞。它可以染色坏死细胞或凋亡晚期细胞（丧失细胞膜完整性细胞的细胞核）。PI可以由488、532或546 nm 的激光激发，呈现红色荧光。PI染料因溶解度欠佳，很容易粘附在流式细胞仪的管路上，导致管路堵塞，很麻烦。所以PI染色的样本在上机检测之前和之后都需要彻底多次清洗仪器，减少仪器发生管路堵塞问题。RNA处理：DNA和RNA都可染上PI，PI是一种插入性核酸荧光染料，能选择性地嵌入核酸DNA双链螺旋的碱基之间并发出荧光，但也可以插RNA的双链区，所以RNA酶消化后分析的结果更准确。FITC-Annexin V：绿色荧光探针FITC 标记的 Annexin V，即FITC-Annexin V。可以标记早期凋亡细胞。在细胞发生早期凋亡时，磷酯酰丝氨酸会外翻到细胞表面，即细胞膜外侧。Annexin V选择性结合磷酯酰丝氨（phosphatidylserine, 简称PS），从而检测细胞早期凋亡。FSC(Forward scatter)，即前向角散射光，它的值代表细胞的大小。细胞体积越大，其FSC值就越大。当细胞通过流式细胞仪的激光束时，检测器会检测到细胞的散射光，放置在前面的检测器检测FSC。SSC(side scatter, SSC)，即侧向角散射光，它的值代表细胞的颗粒度（granularity），比如细胞核、细胞器等颗粒。细胞越不规则，表面的突起越多，细胞内的细胞器或者颗粒性物质越多，其SSC值就越大。当细胞通过流式细胞仪的激光束时，检测器会检测到细胞或颗粒的散射光，放置在侧面的多个检测器检测SSC。一般情况下，不同细胞群的FSC值和SSC值最多相差几倍，所以，流式图的数轴上FSC值和SSC值以“一般数序形式”表示。但是，荧光信号强弱之间一般相差很大，阴性细胞与阳性细胞之间有时可以相差几十倍、甚至几千倍，呈指数关系。所以，流式图的数轴上，荧光通道值常以“对数形式”（logarithmic scale）表示。散点图的参数FSC-A与FSC-H中的A是area细胞面积的缩写，H是height细胞高度的缩写。参数W，是width的缩写，是这个拱的宽度，代表细胞通过激光束所花的时间，这个参数一般用不到。门（gate）是流式分析过程中一个较为重要的概念，说白了就是选定一部分你要分析的细胞。上机速度：流速越高，CV值越大，进行DNA分析时，尽量采用最低流速。PI的检测通道在大多数仪器上是选择PE通道（有PI专用通道的仪器才选择PI）。PI的坐标选线性：线性更能体现DNA含量的倍数关系。CV是变异系数，越小，峰形越好，越尖锐，<5%左右是比较好的结果，一般<10%才认可。细胞碎片越少、细胞聚团越少、RNA酶消化越充分，CV值越小。细胞死亡（Death）形式包括凋亡（Apoptosis）、坏死(Necrosis)和自噬（Autophagy）。近年来被广泛关注的是替代性细胞死亡，包括细胞焦亡（Pyroptosis）、坏死性凋亡（Necroptosis）、铁死亡（ferroptosis）、铜死亡(Cuproptosis)等。 细胞凋亡一般要用两种染色剂。
碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）：检测凋亡晚期细胞。 FITC-Annexin V：标记早期凋亡细胞。 
安捷伦生物 ACEA NovoCyte系列流式细胞仪的上机操作入门视频： https://www.bilibili.com/video/BV1Gc411o7ud/?vd_source=c5d7403d1b2832c643e831d68ff1474c 上机常用设置！
去除二聚体细胞！
https://www.bilibili.com/video/BV1Nr4y1g7du/?spm_id_from=333.788.recommend_more_video.0&vd_source=c5d7403d1b2832c643e831d68ff1474c
相同的高度下，面积大的那一群细胞，就是粘连的细胞！流式细胞仪分析的是单个细胞。
安捷伦流式细胞仪的NovoExpress分析软件在每台电脑安装后提供30天试用期。NovoExpress授权码可以从ACEA 单独购买。 仪器用完之后，处理流程（PDF文件30页）： 1.排气泡（可选）：清除样本管路中存在的气泡。用时2-3分钟。运行排气泡操作之前，需要在样本架上放置一管至少1mL的75%医用酒精。 2.清洗：清除生物危害。用时约7分钟。 3.冲洗：用时约7分钟。 4.强化冲洗（可选）：用时约12分钟。 5.灌注：长时间未使用机器时，用新鲜的鞘液充满管路，并清除气泡。用时约3.5分钟。 6.清除堵塞（必要时）：若Flow Cell堵塞，点击该菜单项清除堵塞。用时约9分钟。 7.反冲（必要时）：若样本管路堵塞，点击该菜单项清除堵塞。用时约5分钟。 图的参数设置（PDF文件74页）：图的参数可以设置为图所属样本中包含的任一参数。 要改变X轴参数，在图下方X轴参数区域的右键菜单中选择需要的参数。 要改变Y轴参数，在图左侧Y轴参数区域的右键菜单中选择需要的参数。 参数列表中“Height”表示高度，“Area”表示面积，“Width”表 示宽度，“Time”表示时间。而“Count”只出现在Y轴参数区域的右键菜单中，是柱状图固定的Y轴参数。 图层：81页。把研究组、对照组放在一起。 平滑密度图：83页。
|
