一文了解流式细胞术

缘起：

最近给客户介绍公司代理品牌的时候，客户问起你们公司代理的BD折扣是多少？那BD究竟是一个什么公司？说起BD，那就不能不说起流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）。BD公司全称BD Biosciences ，中文名碧迪，成立于1897年，是世界上最大的生产和销售医疗设备、医疗系统和试剂的医疗技术公司之一。1973年推出全球第一台商业化流式细胞仪，开创并确立了研究细胞的最先进技术。BD流式产品占据超过40%的全球市场份额，在过去的50年中，一直处于领先地位。

流式细胞术概述：

流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）从字面意义理解，Flow—Fluid、Cyto—Cell、Metry—Measurement，是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒（如微球，细菌，小型模式生物等）逐个进行快速定量分析和分选的技术。其特点是通过快速测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收来定量测定细胞 DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。根据这些参数将不同性质的细胞分开，以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体。广泛运用于从基础研究到临床实践的各个方面，涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等领域，在各学科中发挥着重要的作用。

流式细胞术简史：

20世纪初，细胞计数还只能用细胞计数板。

1934年Moldaven试图用光电仪记录流过1根毛细管的细胞数量，这是细胞检测自动化的最早想法，实现了从静止细胞到流动细胞的微观计数。但是该方法灵敏度较低，误差较大。

1953年，Parker 和 Hutcheon 发明了一种全血细胞自动计数仪并取得专利，成为流式细胞仪的雏形。该仪器的灵敏度和精准度大幅提高。然而，该细胞计数仪只能计算出全血的细胞数量，并不能计算出每种血细胞的数量。

1965年，Fulwyler MJ在前人的基础上提出了真正意义上的流式细胞仪概念，并将该设想发表在《Science》杂志上（Fulwyler MJ. Electronic separation of biological cells by volume. Science, 1965, 150(3698): 910-911）。

1969年，根据该设想，Fulwyler MJ与Wolfgang Göhde发明了第一台荧光流式细胞仪并申请了专利。该设备不仅能够检测出经荧光标记抗体染色的细胞的较弱荧光信号，而且具有细胞分选功能，开创了细胞免疫荧光染色和检测技术的新纪元。

1973 年，BD 公司与美国斯坦福大学合作，研制并生产了世界第一台商用流式细胞仪 FACS I。自此，FCM 进入飞速发展的新时代。

流式细胞术原理：

特定波长的激光束直接照射到高压驱动的液流内的细胞，产生的光信号被多个接收器所接收，包括激光束直线方向上接收到的散射光信号（前向角散射）和激光束垂直方向上接收到的光信号（散射光信号（侧向角散射）和荧光信号）。液流中悬浮的直径从0.2-150 μm的细胞或颗粒能够使激光束发生散射，细胞上结合的荧光化合物被激光激发后能够发射荧光。散射光信号和荧光信号被相应的接收器接收，根据接受到的信号的强弱从而反映每个细胞的物理学特征。

分析型流式细胞仪检测原理：

将待测样品制成单细胞悬液，在鞘液的包裹下进入流式细胞仪内的检测区域，细胞在激光的照射下会发生散射和折射，产生的散射光信号和荧光信号由不同的通道接收。其中前向角散射光（FSC）的强度与细胞直径成正相关，可以理解为细胞直径越大，FSC越强，细胞直径越小，FSC越弱。所以可以利用细胞的FSC值初步比较细胞的大小，利用FSC值对细胞进行分群和分类。  

侧向角散射光（SSC）的强度与细胞内颗粒结构复杂程度成正相关（与细胞中所含的细胞器、细胞核等的数量成正比），可以理解为细胞内颗粒结构越复杂，SSC越强；细胞内颗粒结构越简单，SSC越弱。所以可以利用细胞的SSC值初步比较细胞的颗粒度，利用SSC值对细胞进行分群和分类。

当细胞通过激光束时，检测器会检测到细胞或颗粒的散射光，放置在前面的检测器检测FSC值，而放置在侧面的多个检测器检测SSC值。通过综合分析前向散射FSC和侧向散射SSC的数据，便能根据细胞大小、形状和复杂度将其进行分群分类。由于样品细胞不需要标记任何荧光化合物偶联抗体，直接上样分析得到FSC值和SSC值，其值代表细胞的大小和颗粒度两个物理特征，所以FSC-SSC散点图又称为 “物理图”。

分选型流式细胞仪检测原理：

当细胞悬液放入样品管中，被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。

流式细胞仪除了根据FSC和SCC散射度或荧光(如DNA、RNA或蛋白含量，酶活性，特异抗原) 散射度差异来分离细胞外，更多的采用细胞表面抗原标记的荧光强度差异来分离细胞。每种细胞表面具有独特的抗原，当形态学检测难以区别时，免疫表型参数对细胞分选有决定性作用。

荧光通道表示的不是细胞特有的物理特征，而是其生物化学特征，通常使用荧光化合物对细胞表面抗原进行标记。荧光通道接收到的信号越强，表示细胞上结合的荧光化合物越多，那么细胞表面表达的该CD分子就越多，因此可根据荧光信号的强弱判断样品中是否有细胞表达该CD分子（即区分阳性细胞和阴性细胞）以及细胞表达该CD分子的相对数量等信息。

流式细胞术结果：

荧光信号和散射光信号通过波长选择的滤光片，由相应的光电管和电子检测器接收并转换成电信号，经放大器放大后送入计算机并进行分析显示和结果输出，测定的结果常用流式直方图、流式散点图、流式密度图和流式等高线图来表示。

1.直方图（Histograms）

流式直方图本质上就是统计直方图，是累积显示细胞量非常大而统计区间又非常小的统计直方图。横坐标代表荧光信号或散射光信号的相对强度，可以是线性或对数坐标；纵坐标一般是相对细胞数。

2.散点图（Dot plots）

散点图十分利于两参数作图，FSC和SSC分别对应x轴和y轴上，并且细胞计数以密度（点）图或轮廓图的形式显示，可显示其频率分布，同时也可以不同的颜色以标识给定位置的单元格密度。当用象限标记将散点图分为四个部分时，在直方图理解的基础上，可知右上象限表示荧光标记均为阳性或双阳性细胞，而左下象限则恰恰是显示两个标记均为负的细胞，左上象限和右下象限则分别代表只对y轴参数或x轴参数标记为正的细胞。

3.密度图（Density plot）

密度图不仅能够表示一个标记的表达水平，还能显示给定区域中事件的相对数量（密度）。分别为密度图、斑马线图和伪彩图。

4.等高线图（Contour plots）

流式等高线图的意义和实际应用与流式散点图较为相似，可以看作是流式散点图的一个变体。相比之下，流式散点图更为直观，所以应用也更为广泛。当然，流式等高线图也有其自身的优点，它较能直观地体现细胞群的集中点，等密度环线的中央区域代表一个细胞群的集中点，一般代表一个细胞群，所以在某些情况下，流式等高线图比流式散点图更能直观地体现细胞的分群。

流式细胞术样本类型：

流式细胞仪可检测多种样本：外周血、骨髓、细胞穿刺液、洗脱液、实体组织、培养细胞、微生物。

流式细胞术应用：

1.流式细胞术可以用来检测细胞表面以及胞内的各种标志，对细胞进行分群鉴定以及各种蛋白表达量高低的比较。不仅仅是免疫细胞，其他的如肿瘤细胞、成纤维细胞、干细胞等都可以用流式细胞术进行检测分析和分选。

2.通过标记Ki67、BCL-2、caspases等增殖及凋亡相关基因，流式细胞术可用来检测细胞的增殖以及凋亡。

3.流式细胞术可用来分析细胞周期。细胞核DNA含量随着细胞增殖周期时相的不同而发生变化，用DNA染料进行染色，DNA含量多，荧光信号强，DNA含量少，荧光强度低。在肿瘤学研究中尤其常用，可以用于判断药物对肿瘤细胞影响、肿瘤的生长速度等。

题外：

流式荧光检测技术，也称为液相芯片技术或微球体悬浮芯片，是基于美国Luminex公司开发的xMAP技术的新型生物芯片技术，继化学发光技术之后的新一代高通量诊断技术平台。流式荧光技术是首个通过FDA认证的临床应用型高通量诊断技术，并于2005年获得了全球科技产业和行业研究的权威机构Frost&Sullivan授予的“临床诊断技术革新大奖”。Luminex 200作为代表机型，已于2009年获得CFDA《医疗器械注册证》。

其技术原理为用不同配比的两种红色分类荧光染料将直径为 5.6 微米的聚苯乙烯微球染成不同的荧光色，从而获得多达 100 种荧光编码的微球。把针对不同待测物的抗体分子或者基因探针以共价交联的方式结合到特定的编码微球上，每个编码微球都对应相应的检测项目。先把针对不同待测物的荧光编码微球混合，然后加入待测物质或者待测的扩增片段，所形成的复合物再与标记荧光素发生结合反应。微球在流动鞘液的带动下单列依次通过红绿激光，红激光用来判定微球的荧光编码，绿激光用来测定微球上报告分子的荧光强度。从而达到快速准确的定量检测目的。

流式荧光最突出的特点就是多指标联检。因其这一特点，使其与化学发光相比有一定优势。