中国海南百岁老人肠道菌群宏基因组和培养组
Deep insights into the gut microbial community of extreme longevity in south Chinese centenarians by ultra-deep metagenomics and large-scale culturomics
Article，2022-04-19，npj biofilms and microbiomes，[IF 9.2]
DOI：https:///10.1038/s41522-022-00282-3
原文链接：https://www./articles/s41522-022-00282-3
第一作者：Congyong Li, Zhe Luan, Yiming Zhao
通讯作者：Chongming Wu, Shufang Wang, Yunsheng Yang & Gang Sun
肠道微生物在人类长寿中发挥着重要作用，百岁老人的肠道微生物群特征显示出一些与年轻人不同的独特特征。如今，大多数关于长寿的微生物研究通常基于宏基因组测序，这可能会丢失丰度极低的功能微生物的信息。在这里，作者结合深入的宏基因组测序和大规模培养组学，揭示了中国长寿人群独特的肠道微生物结构，并探讨肠道微生物与长寿之间的可能关系。25名健康的海南人参与了这项研究，其中包括12名百岁老人和13名老年邻居。从单个粪便样本中获得平均51.1Gb的原始测序数据。作者组装了1778个非冗余宏基因组组装基因组(MAG)，其中33.46%无法归类为已知物种。与海南省普通人群相比，长寿人群的丁酸产生菌丰度显著下降，而大肠杆菌、猪脱硫弧菌和史密斯甲烷短杆菌的比例大幅增加。这些物种随着衰老而不断变化。作者还通过大规模培养组学从这些样本中分离出8030株菌株，其中大部分属于MALDI-TOF鉴定的203个已知物种。令人惊讶的是，只有42.17%的分离物种也被宏基因组学检测到，这表明这两种方法之间存在明显的互补性。两种补体方法、深入的宏基因组测序和培养组学的结合，可以更深入地了解与长寿相关的肠道微生物群。海南高寿人群独特丰富的肠道微生物可能有助于促进健康和长寿。
当今世界正面临着日益严重的老龄化问题。如何延长人们的健康和寿命已成为人们关注的焦点问题。人们付出了极大的努力来探索衰老的根本机制，并试图通过确定调节衰老的关键因素来延缓衰老的进程。衰老涉及多种途径，其中遗传因素被认为占25-30%，而环境因素则占其他70-75%。在各种环境因素中，肠道微生物群与人类健康和长寿密切相关。各种动物模型的实验表明，肠道微生物群在宿主寿命的调节中发挥着重要作用。临床研究还表明，百岁老人的肠道微生物特征与普通老年人不同。因此，详细描述极度衰老和健康的百岁老人的肠道微生物群落并识别有助于长寿的关键分类群可能为实现健康衰老提供新策略。
肠道微生物群的多样性和组成与年龄呈非线性关系。老年人和年轻人的肠道微生物群高度相似，而百岁老人的肠道微生物群则表现出一些差异。在百岁老人中，罗斯氏菌属和埃希氏菌属水平显着高于非百岁老人，而乳杆菌、粪杆菌、副拟杆菌、丁酸单胞菌、粪球菌、巨单胞菌、Mitsuokella、Sutterella和Akkermansia在属水平上显着低于非百岁老人。目前，大多数长寿宏基因组研究都是基于16S rRNA基因扩增子测序，无法提供功能信息。Wu等人使用鸟枪法宏基因组学方法研究了生活在意大利撒丁岛的百岁老人的肠道微生物群结构。他们的结果表明，百岁老人中普氏粪杆菌和直肠真杆菌的丰度下降，而史密斯甲烷短杆菌和青春双歧杆菌的丰度显着丰富。功能分析显示，百岁老人具有较高的代谢能力，特别是糖酵解和短链脂肪酸（SCFA）发酵能力，而编码碳水化合物降解酶（包括纤维和半乳糖）的基因较低。肠道微生物群的变化可能是衰老的结果或促成因素。百岁老人通过适应、调整和抵抗外界生物和非生物的挑战，已经达到了生命的极限。它们可以通过多种方式维持肠道稳态，从而实现人们的长寿。然而，仍有必要进一步探讨肠道菌群与衰老的关系。
尽管已经进行了大量研究来探索肠道微生物群与长寿之间的关系，但宏基因组学是大多数研究中用于描述肠道微生物组成的唯一技术。然而，基于DNA测序的方法有几个固有的缺点，例如由于DNA过程偏差、深度偏差、基因组数据库不完整而导致组装结果不准确，以及在某些情况下无法检测丰度低的致病细菌。分析不提供可进一步进行菌株特征或功能评估的活微生物。宏基因组学的这些缺点使得健康百岁老人的实际肠道微生物群还远未被完全了解。培养组学的最新进展使我们认识到，在正确的培养条件下，所有微生物都可以培养，这为宏基因组测序提供了有效的补充，以全面表征肠道微生物组成。尽管如此，培养组学已被认为是描述肠道微生物群的重要方法。目前，培养组学和宏基因组学表现出高度互补性，因为只有15%的检测物种同时使用这两种技术。然而，这些结果是通过正常的宏基因组学和小规模培养组学获得的，仍需要超深度宏基因组学和大规模培养组学的结合来证明这一结论。
在这项研究中，作者招募了来自中国南方海南省的25名老年人，其中12名百岁老人、4名百岁老人的直系后代和9名极其几十年的邻居。他们的粪便样本通过超深度宏基因组测序（每个样本51.1Gb）和大规模培养组学分析（每个样本321.2个菌株）进行了深入分析。通过超深度宏基因组学和大规模培养组学共发现了897个已知细菌物种，其中42.17%的物种在这两种方法中同时存在，显示出良好的互补性。作者比较了这个海南人群中百岁老人和非百岁老人的差异，也比较了这个长寿人群与海南省普通人的微生物组成。结果表明，一些肠道细菌种类随着衰老而发生一致变化，这意味着它们可能在维持健康和长寿方面发挥作用。
共有25名中国南方海南老人参与了这项研究，其中包括12名百岁老人、4名百岁老人直系后代和9名老邻居。所有个体平均年龄91.72岁，其中男性14例，女性11例（表1）。根据多学科健康评估，这些人都很健康，没有明确的疾病。所有受试者均为杂食性饮食，并且在研究前3个月内未服用抗生素。25名受试者中有24名在日常生活中不饮酒。一般来说，百岁老人与非百岁老人除年龄外，其他共同特征没有显著差异。
Metagenomics/sequencing and metagenome-assembled genomes (MAGs)
通过超深度宏基因组分析来描述海南长寿人群的肠道微生物组成。总共获得了1277.7Gb的原始序列数据，每个样本的平均测序深度为51.108Gb。单个样本的读序范围为242,836,682至468,165,554。采用MetaWRAP pipeline方法重建海南长寿人群宏基因组，经过严格的质量控制（完整性和污染检测）后获得2421个宏基因组组装基因组（MAG）。根据99% ANI阈值组装这些MAG，并根据Bowers标准获取了1159个中等质量MAG和1262个高质量MAG（图S1、表S2）。
2421个MAG在GTDBTk数据库中进行了比对，用于分类单元分类。经过全基因组遗传距离量化后，通过跨越5%遗传多样性的基因组框聚类，共鉴定出717个物种，分属于99科、43目、22纲和14门。14个门中，12个属于细菌，2个属于古菌。厚壁菌门（68.17%，n = 1630）、拟杆菌门（19.53%，n = 467）、变形菌门（3.97%，n = 95）、放线菌门（2.76%，n = 66）和疣微菌门（2.17%，n = 52）是包含最多组装MAG的前5个细菌门，而30个组装的古菌MAG属于Euryarchaeotta广古菌门（n = 23）和Thermoplasmatota热原体门（n = 7）（表S3）。作者利用MAG预测的共同核心基因进一步构建了系统发育树。核心基因衍生的聚类模式与分类分配高度一致，厚壁菌门和拟杆菌门是两个最主要的聚类（图1）。此外，目前可用的参考基因组阵列无法在物种水平上对734个MAG进行分类，这表明很大一部分MAG可能是新物种。使用FastANI计算的平均核苷酸同一性（ANI）来注释MAG的分类。ANI≥95%的MAG被认为是与参考基因组最接近的同一物种，否则将被视为该属内的新物种。这些未分类的MAG包含339个潜在的新物种（表S3）。
图1. 海南长寿人群肠道微生物基因组的系统发育树
使用2421个MAG构建系统发育树。MAG使用GTDB-TK进行编目并用不同的颜色表示。外围蓝色圆圈表示GTDB-TK无法识别的MAG。
The enriched MAGs in centenarians compared to non-centenarians
根据组装的MAG进行物种多样性分析。百岁老人和非百岁老人之间的α多样性和基因丰富度没有显著性（图2A、B）。采用基于物种水平微生物群落的Bray-Curtis距离的主坐标分析来识别两组肠道微生物结构的相似性。百岁老人和非百岁老人的肠道微生物群落结构和功能基因谱相似（图2C、D）。
图2. 百岁老人和非百岁老人的肠道微生物群组成没有显著差异
(A) 阿尔法多样性；
(B) 基因丰富度；
(C) 基于种级微生物群落的主坐标分析（PCoA）分析。通过多响应排列程序（MRPP）分析计算显着性；
(D) 功能基因谱，两组之间没有显著差异。
为了找到随年龄变化而变化的关键类群，作者将海南长寿受试者进一步分为三个亚组（组1：6名年龄在85岁以下的受试者；组2：7名年龄在85岁至100岁之间受试者；组3：包含12位百岁老人）。作者比较了三个亚组中2421个MAG的丰度。在门水平上，85-100岁的人群中厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门、协同菌门和疣微菌门的丰度最高，而年龄<85岁或>100岁的人这些门的丰度较低。值得注意的是，百岁老人比其他两组人含有更高丰度的变形菌门和广古菌门（古细菌）（图3A）。在属水平上，Agathobacter、Escherichia和Roseburia的丰度随着年龄的增长而不断增加（图3B），这主要归因于Agathobacter faecis、Agathobacterectale、Escherichia coli和Escherichia flexneri的富集（图3C）。此外，四种史密斯甲烷短杆菌（古细菌）、大肠杆菌、普氏菌和脆弱拟杆菌在百岁老人中高度富集（图3C），表明这些物种的富集与极长的寿命有关。
图3. 不同年龄组的门、属、种水平MAG丰度
年龄<85岁（组1）、85-100岁（组2）和≥100岁（组3）受试者的门（A）、属（B）和种（C）水平的MAG丰度。MAG的丰度由metaWRAP计算。所有类群在群体间均无显著性。
The main taxa that are significantly different between the longevous and ordinary population in Hainan province
然后，作者将这一长寿队列中1778个MAG的宏基因组数据与居住在海南省的参考人群的宏基因组数据进行了比较，以找到随着衰老而发生显着变化的主要类群。百岁老人（n = 12）和老年人（n = 13）来自的长寿队列，而参考成年人（n = 24，18-45岁）来自已发表的论文。各组之间肠道微生物群的α多样性没有显著差异（图4A）。PCoA和非度量多维标度（NMDS）分析表明，肠道微生物结构随着衰老不断变化（图4B、C）。门水平的微生物组成显示，随着年龄的增长，变形菌门大幅增加，而放线菌门不断减少（图4D），这主要归因于肠杆菌目的增加和双歧杆菌目的减少（图4E）。对个别肠道菌种的检查显示，老年人和百岁老人组中产丁酸菌如普氏粪杆菌、霍氏真杆菌、腹真杆菌、支枝肠球菌、Lachnospiraceae_bacterium_5_1和乳瘤胃球菌明显减少，而大肠杆菌等机会致病菌则显著减少、猪脱硫弧菌和产气荚膜梭菌在长寿组中增加（图4F）。值得注意的是，产甲烷菌史密斯甲烷短杆菌在长寿队列中大量存在。38号志愿者虽然只有50岁，但他的肠道微生物群落中史密斯氏菌的含量为2.23%，远高于该物种在海南省普通人群中的平均丰度（0.098%）。对物种丰度随年龄的回归分析显示，产生丁酸盐的物种如普氏粪杆菌、霍氏真杆菌、腹真杆菌和Lachnospiraceae_bacterium_5_1_63FAA与衰老呈负相关，而大肠杆菌、产气荚膜梭状芽胞杆菌、猪脱硫弧菌和产甲烷菌等机会性病原体与年龄呈显着正相关（通过Benjamini-Hochberg检验，q < 0.05）（图5）。
图4. 中国海南长寿人群与普通成年人的肠道菌群存在显着差异
(A) 阿尔法多样性；
(B) 主坐标分析（PCoA）分析；
(C) 非度量多维标度分析；
(D、E) 门(D)和目(E)级别的微生物概况；
(F) 随着衰老而不断变化的主要物种。Lb_5_1: Lachnospiraceae_bacteria_5_1。
* P< 0.05，**P < 0.01，*** P < 0.001。
图5. 个体物种丰度与年龄的回归分析
进行非参数斯皮尔曼相关分析以监测个体物种和年龄的相关性。
The sequencing depth is saturated at 50 Gb per sample
为了验证50 Gb深度测序是否足以进行彻底的宏基因组分析，进行了稀疏分析。当单个样本的测序深度超过3 × 108个reads（约40 Gb）时，稀释曲线变得平坦（图6），表明测序深度接近饱和，通过额外测序获得的新系统发育型很少。因此，应采取新的方法从粪便中获取更多的细菌成分。
图6. 香农或辛普森指数所示的稀疏曲线
上图以箱线图格式显示了不同序列号下观察到的物种，下图表示相同的情况并以线回归格式绘制数据。观察到的物种数量迅速增加，直到测序读序达到5e7，之后观察到的物种数量仍然增长。
The gut microbial composition assessed by culturomics
作者进一步进行了培养组学，以全面了解影响长寿的肠道微生物群组成。为了从海南长寿人群粪便样本中彻底分离肠道菌群，采用23种培养基和98种预处理条件，最终获得8165株菌株。MALDI-TOF MS鉴定显示，8123株菌株属于235种已知肠道细菌物种，其他42株菌株属于未定义物种（表S4）。总体而言，在厌氧条件下获得了256种6979株，其中包含41种未定义物种；在微氧条件下获得了89种1186株，其中包含1种未定义物种（表S5）。分离菌属于7个门，包括厚壁菌门（134种）、变形菌门（38种）、拟杆菌门（27种）、放线菌门（19种）、梭菌门（2种）、子囊菌门（1种）、伞形菌门（1种）。总共鉴定出69个属，其中主要是乳杆菌属、芽孢杆菌属、肠球菌属、链球菌属和梭菌属（图7，表S5）。
图7. 基于培养组学获得的肠道细菌的系统发育树
橙色、黑色、红色、蓝色和绿色分支分别代表厚壁菌门、梭杆菌门、放线菌门、拟杆菌门和变形菌门。圆圈面积代表属于每个物种的分离菌株的数量。
每个受试者的平均分离菌株数（322.92 vs. 317.77，p = 0.959）和物种数（48.00 vs. 53.62，p = 0.592）在百岁老人和非百岁老人之间相似（表S6）。然而，约氏乳杆菌（3.08 vs. 0.08）、L. kalixensis（4.58 vs. 0.15）、L. oris（2.75 vs. 0.23）、L. agilis（5.67 vs. 0.62）、L.gasseri（4.42）的平均数量在百岁老人中的细菌数要高得多，而伯氏短杆菌（0.00 vs. 4.08）、Mitsuokella multacida（0.33 vs. 4.62）、阿氏肠球菌（0.25 vs. 3.00）、假长双歧杆菌（0.25 vs. 3.00）和罗伊氏乳杆菌（1.33 vs. 8.23）在非百岁老人中较高（表 S7）。一般来说，百岁老人的可培养乳酸菌和肠球菌含量较高，这与宏基因组分析一致（图4E）。
7. 培养组学是宏基因组学的重要补充，可以全面了解肠道微生物群
Culturomics is an important complement for metagenomics to gain a thorough insight of gut microbiota
在这项研究中，使用不依赖培养（宏基因组学）或依赖培养（培养组学）的方法总共鉴定了1430个物种。具体来说，宏基因组研究鉴定了1290个物种，其中587个和796个物种分别通过基于metaphlan2和MAG的方法鉴定，而256个物种通过培养组学鉴定。通过宏基因组学和培养组学共同鉴定出116个物种（图8）。仅通过培养组学就鉴定出了总共140个物种（图8），这表明培养组学是宏基因组学的重要补充，可以全面了解肠道微生物群。
图8. 通过宏基因组学（metaphlan2和MAG算法）或培养组学鉴定的物种的韦恩图
为了鉴定获得的物种，作者匹配了物种信息、样本信息和基因组序列数据，然后绘制了宏基因组测序中每个菌株的宏基因组丰度。无法获取物种丰度信息的培养物种有144个，占培养物种的69.90%。有些属，如芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属、哈夫尼亚属、假单胞菌属和沙门氏菌属，无法通过宏基因组学检测到，但经常通过培养组学分离出来（图9），这可能是由于它们的丰度较低或难以提取DNA。
图9. 通过培养组学分离菌株的概述
右侧显示海南百岁老人（C）和非百岁老人（E）粪便中各菌种的分离株数。左侧部分表示通过宏基因组分析得出的粪便样本中每个物种的相对丰度（%）。
Li, C., Luan, Z., Zhao, Y. et al. Deep insights into the gut microbial community of extreme longevity in south Chinese centenarians by ultra-deep metagenomics and large-scale culturomics. npj Biofilms Microbiomes 8, 28 (2022). https:///10.1038/s41522-022-00282-3
担任中国药理学会心血管药理专业委员会委员，中国中医药信息学会中医临床药学分会常务理事，中国老年保健协会食药物质与健康分会委员，国家重点研发计划会评专家，热心肠研究院智库专家。Mol Med Rep, Chinese Herb Med, Integr Med Nephrol Androl, Disease Res等多家国际期刊的编委或青年编委。长期从事中药药理学研究，聚焦肠道微生物组与人类慢性疾病的发生发展关系以及药物通过调节肠道菌群发挥功效的作用机制研究。建立了大规模的人类肠道活菌库和肠道菌与人类常见疾病的关联信息库，在菌种和菌株层面开展了广泛的基因组、代谢组、药理活性和菌药互作研究，目标是通过对人类肠道菌群进行精准操控，实现健康的维护和疾病的治疗。迄今发表相关科研论文100余篇，被引用2500余次。
消化内科医学部副主任医师。擅长消化道常见病诊治和消化道早癌内镜诊疗。担任中华医学会消化内镜学分会八届委员会儿科协作组委员、北京医学会消化内镜学分会青年委员会委员。承担省重点研发课题、院苗圃重点课题、院临床科研扶持课题各1项，完成2项软件著作权，发表中英文文章40余篇。获省部级科技进步一等奖、二等奖各1项，军队科技进步一等奖1项。
消化内科医学部学术委员会主任，主任医师、教授、博士生导师，历任消化科主任、消化病中心主任、全军消化内科研究所长、亚太消化内镜培训中心主任等；现任消化内科医学部学术委员会主任。擅长消化内科疑难病、胃食管反流病、胰胆疾病、炎性肠病、ERCP等消化内镜微创治疗，微生态有关疾病如幽门螺杆菌相关疾病、自闭症等治疗。担任中华消化病学会第十届主任委员、微生态学组组长，中华消化内镜分会第五届副主任委员，北京医师协会消化医师分会第二届会长等；中华内科杂志、中华消化杂志、中华消化内镜杂志副总编等。第一完成人获军队医疗一等奖、科技进步及教学二等奖等3项。享受国务院政府特殊津贴，获中国首届名医奖，科学中国人奖等。发表论文400余篇，SCI收录论文100余篇，主编专著3部。
消化内科医学部消化内科亚专科主任、主任医师、教授。擅长消化系统复杂疑难疾病诊断治疗、消化系急危重症救治、复杂高级内镜治疗、胰胆疾病ERCP技术、消化道早癌治疗ESD技术、食管胃静脉曲张精准治疗及肠道微生态失调相关疾病。担任中华医学会消化系病学分会全国委员、北京医学会消化病学分会常委。获省科技进步二等奖、军队科技进步二等奖各1项。参编专著多部。
