这是以色列特拉维夫大学于2020年发表于《Frontiers in Immunology》上的一篇综述文章，阐明了单克隆抗体治疗后 ADAs 形成的免疫生物学分子机制，可以作为理解 ADA 的一篇经典文章。
1 摘要
单克隆抗体 (mAbs) 是现代医学中重要的治疗药物，但是 mAb 的重复使用可能引起高度的免疫原性。药物免疫原性体现在抗药物抗体 (anit-drug antibodies ADA) 的生成中，一些 mAb 在高达 70% 的患者中都表现出免疫原性。ADA 可以改变药物的药代动力学和药效，从而降低药物疗效。在更严重的情况下，ADA 可能会抵消药物的治疗效果或对患者造成严重的不良事件。因此，准确的 ADA 检测是必要的。本篇文章概述了 ADA 形成的可能机制以及可用于检测其的诊断工具。最后，文章也简介了用于降低 mAb 诱导 ADA 倾向的方法。
2 引言
迄今为止，超过 73 种 mAb 获得美国食品药品监督管理局 (FDA) 和欧洲药品管理局 (EMA) 的批准。还有数百种 mAb 正处于临床开发的不同阶段。mAb 可用于各种临床适应症，包括癌症、慢性自身免疫性疾病和炎症性疾病、过敏、感染、移植和心血管疾病。
mAb 根据靶点的不同作用机制 (mechanism of action MOA) 有所不同：
1、抗 CD20 利妥昔单抗通过与表面受体结合诱导细胞死亡，从而产生导致细胞凋亡的信号级联反应
2、抗 HER-2 曲妥珠单抗，可阻断受体-配体相互作用以达到预期效果，方法是阻断受体结构域，从而去除可溶性配体来抑制激活信号
3、mAb 可以诱导 Fc 依赖性效应功能，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC) 和补体依赖性细胞毒性 (CDC)
4、mAb 可以靶向参与疾病发病机制的特定蛋白质，例如用于治疗炎症性肠病 (IBD) 和类风湿性关节炎 (RA) 的抗 TNFα 英夫利昔单抗和阿达木单抗
5、检查点抑制剂 mAb 也被开发用于操纵抗肿瘤 T 细胞反应，例如用于治疗黑色素瘤和非小细胞肺癌的抗 PD-1 纳武单抗
20世纪80年代末，鼠源单克隆抗体进入快速临床开发阶段，但存在明显的缺点，因为它们经常诱发过敏反应并形成人抗小鼠抗体（HAMA）。为了克服鼠源 mAb 的免疫原性和效应功能降低，后续通过将鼠 mAb 的抗原特异性可变区与人 mAb 的恒定区融合来开发嵌合抗体（小鼠-人）。嵌合单克隆抗体的开发确实降低了免疫原性并提高了功效。例如，接受嵌合mAb 17-1A的转移性结直肠癌患者没有表现出任何毒性或过敏反应，并且嵌合抗体的免疫原性明显低于其亲代鼠源抗体。嵌合 mAb 表现出延长的半衰期和降低的免疫原性，但它们仍然表现出相当高的 ADA 诱导倾向。为了进一步降低 mAb 的免疫原性，通过将鼠互补决定区（CDR）移植到人 mAb 重链和轻链可变结构域（分别为V H 和V L ）的框架区（FR）上来开发人源化mAb。mAb 人源化通常会显著降低免疫原性和 ADA 形成 。虽然人源化和全人源 mAb 均降低了免疫原性潜力并显示出与人内源 IgG 相似的特性，但它们未能完全消除 mAb 免疫原性和 ADA 形成。表 1 总结了目前在美国和欧盟批准的 mAb 及其报告的免疫原性率。
表1 批准 mAbs 的ADA发生率
mAb 的免疫原性主要表现在ADA的生成上。ADA 的形成会改变药物的生物利用度以及药代动力学和药效学特性，并且通常会降低药物疗效 。ADA 对 mAb 药物安全性也具有重大影响，因为它们可能在临床中导致严重的不良免疫反应。例如，ADA 会影响临床治疗过程的分层。当所给予的 mAb 在治疗开始后几周内未能显示出任何疗效时，患者被指定为原发性反应丧失；当患者表现出明显的副作用或尽管有初始治疗反应但药物随着时间的推移而失去有效性时，患者被指定为继发性反应丧失。
3 ADA 形成的分子机制
抗药物抗体可以通过 T 细胞依赖途径或独立的 B 细胞激活途径产生。在 T 细胞依赖性途径中，mAb 作为抗原，被抗原呈递细胞 (APC) 内化、加工并通过 MHC II 类分子和 T 细胞受体之间的同源相互作用呈递给 T 细胞。根据这种相互作用期间的细胞因子环境，可能会发生几种不同的免疫反应。在 T 细胞依赖性途径中，当 T 辅助细胞 (Th) 分化为 Th1 或 Th2 表型时，就会产生 ADA，并且在与 B 细胞发生同源相互作用后，诱导分泌 ADA 的浆细胞 (PC) 增殖。先前的研究表明，Th2 反应主要诱导 IgG4 同种型的 ADA 产生，而 Th1 反应则在抗因子 VIII 的情况下引发 IgG1 和 IgG2 ADA 的产生。
T细胞依赖激活途径
相比之下，对于T细胞非依赖途径，具有多个表位的 mAb 可以交联 B 细胞受体 (BCR) 并刺激 B 细胞分化为浆细胞 PC 以产生 ADA。先前已证明，mAb 的杂质和聚集体可能会增加 mAb 上相邻表位的数量，从而可能通过 B 细胞交联将免疫反应转向 T 细胞独立途径。
使用 mAb 治疗的患者中出现的 ADA 可分为两大类：
(1) 中和性 ADA ( nt ADA)，直接阻断和干扰药物结合其靶标的能力
(2) 非中和性 ADA（即，结合 ADA b ADA) 识别药物上的其他表位，同时仍保留 mAb 结合活性。
通常认为nt ADA 在临床环境中比b ADA 更重要，因为它们直接降低药物的疗效。然而，b ADA 可能会通过损害生物利用度或加速药物从循环中的清除来间接降低 mAb 的治疗效果。在这两种情况下，nt ADA 和b ADA 显着改变所施用的 mAb 的 PK 和 PD
4 有助于 ADA 形成的药物和患者特征
ADA 的形成取决于多种因素之间的相互作用，这些因素可能与患者相关，也可能与药物相关。Fig 1 总结了 ADA 形成的可能原因。
4.1 患者相关因素
关于 ADA 产生的原因和方式很复杂，因为一些患者会产生 ADA，而另一些具有相同症状并接受相同mAb 的患者却不会。因此，接受相同 mAb 的患者之间的免疫原性程度有所不同，这可能与疾病发生的免疫途径有关。例如，与脊柱关节炎患者相比，RA 患者产生针对 mAb 药物的 ADA 的可能性更高。对于特定疾病或免疫靶点，不同的 mAb 可能对 ADA 的诱导产生不同的影响。当使用两种不同的单克隆抗体治疗时，RA 患者的 ADA 水平会升高。在多发性硬化症 (MS) 患者中，利妥昔单抗（嵌合抗 CD20 mAb）治疗时高达 37% 的患者产生不良免疫反应。相反，用于治疗系统性红斑狼疮 (SLE) 患者的贝利木单抗（一种全人源抗 B 细胞激活因子 (BAFF) mAb）显示出较低的 ADA 诱导率。值得注意的是，在自身免疫性疾病中，先天性和适应性免疫反应的过度激活可能会使 mAb 免疫原性的研究进一步复杂化 。另一方面，当给癌症患者施用 mAb 时，ADA 的形成通常取决于癌症的阶段，疾病早期阶段的 ADA 水平往往高于后期阶段。
所施用的 mAb 诱导 ADA 形成的大部分变异可能是由不同免疫环境造成的；主要是疾病状态和 HLA 等位基因，它们可以促进或抑制 ADA 反应。目前的主要观点是 ADA 形成主要源自 T细胞依赖性途径，因此许多研究重点关注 ADA 形成与人群中的 HLA 多态性的关系。Benucci 等的研究结果表明，携带 HLA-DRβ-11、HLA-DQ-03 和 HLA-DQ-05 等位基因的患者在使用抗 TNF mAb 治疗后出现 ADA 反应的风险更高。在最近的两项研究中，针对英夫利昔单抗和阿达木单抗的 ADA 形成与IBD 患者的HLADQA1 * 05A > G 基因型相关。T 细胞依赖性 ADA 反应的产生也是一个多因素作用的过程，不仅取决于 mAb 中是否存在潜在的 MHC-II 肽表位，还取决于该表位被 T 细胞处理、呈递和识别的能力。在设计 mAb 研发的免疫原性研究和临床试验期间，应考虑 HLA 类型对 ADA 反应概率的影响。如果研究人群与较大治疗人群的 MHC-II 基因背景存在显着差异，小队列的研究得出的结论可能不适用于 ADA 预测。
4.2 药物相关因素
导致 ADA 诱导的分子机制最初认为是与 mAb 的小鼠起源有关，这些 mAb 被人类免疫系统识别为“非自身”。但是，即使使用完整的人类抗体基因也没有完全消除免疫原性和相关的 ADA 诱导 。全人单克隆抗体在 CDR 区中含有新的表位，可以通过独特型/抗独特型相互作用来引导免疫反应 。如上所述，MHC-II 呈递的 mAb 衍生肽对于 T 细胞依赖性 ADA 形成是必需的。在 mAb 制药过程中也一直在努力去除 T 细胞表位，但人类群体的高遗传变异性极大地复杂化了从人类 mAb 中去除所有 MHC-II 结合肽。
Fc 糖基化也可能影响 ADA 的诱导。Fc 区域 N 连接的糖基化的去除被证明可以降低免疫原性。但是，缺乏 Fc 区域的全人单克隆抗体也被证明具有免疫原性，并且对招募巨噬细胞和激活补体的能力有直接影响。例如，半乳糖-α-1,3-半乳糖是一种在人类中未发现的外源聚糖，存在于西妥昔单抗 V H（一种用于癌症治疗的嵌合单克隆抗体，针对 EGF 受体）的抗原结合部位，该聚糖被证明可诱导 IgE 同种型的 ADA 形成，并导致患者出现过敏反应。另一方面，免疫原性有时与配制过程中的杂质有关，而不一定是由于糖基化差异。对 18 种生物仿制药和单克隆抗体原研药之间差异的回顾得出的结论是，它们之间的差异主要在于糖基化模式，并且不影响免疫原性。
mAb 靶标也是 ADA 形成的重要机制。阿仑单抗 (alemtuzumab) 是一种针对 CD52 淋巴细胞表面糖蛋白的 mAb。它用于治疗 MS ，并在约 85% 的患者中诱导 ADA，其中约 92% 的患者产生 neutralizing ADA（nt ADA）。阿仑单抗高频率的 ADA 诱导可能与 CD52 表达模式有关。阿仑单抗靶向 APC 的 CD52表达，其中包括 DC、单核细胞和记忆 B 细胞。当单核细胞重新增殖时，它们遇到循环单克隆抗体，该单克隆抗体快速将抗原呈递给抗原特异性淋巴细胞。记忆 B 细胞在接受阿仑单抗治疗后通常会表现出稳态扩张，这可以补充 ADA 的生成。
mAb 剂量和作用时间也是影响 ADA 形成的因素。尽管某些长期治疗和较高剂量的病例具有较低的免疫原性，但增加注射次数和较高的 mAb 剂量与较高的 ADA 风险相关 。例如，利妥昔单抗（rituximab）是一种抗 CD20 嵌合单克隆抗体，在前 B 细胞和 B 细胞分化为 PC 之前靶向其表面抗原。由于利妥昔单抗选择性地消耗 CD20 阳性 B 细胞，因此它不会影响成熟的 PC，并且不具有引发 ADA 的倾向。
5 免疫原性评估分析和免疫原性降低工具
5.1 临床前处理
由于 mAb 免疫原性的重要性日益增加，对评估免疫原性和降低 mAb 诱导 ADA 倾向的工具的需求也越来越大。主要包括计算机预测算法工具和基于细胞的实验工具两个方面。
计算机CD4 + T 细胞表位预测模型通常用于识别潜在的免疫原性 MHC-II 肽表位。这些算法基于 mAb 衍生肽与 MHC-II 的亲和力，如 NetMHCIIpan-4.2 。例如，在临床试验中，重组 Fc 融合蛋白的 T 细胞表位的计算机评估与给患者施药时的免疫原性率之间发现了很强的相关性。虽然此类预测算法很常用，但它们仅捕获系统复杂性的一小部分。大多数CD4 + T细胞表位预测算法基于与MHC-II分子的结合亲和力和稳定性，但未能考虑T细胞表位识别中的其他重要因素。这些因素包括蛋白酶切割位点 、T 细胞前体频率以及肽和 T 细胞竞争。
实验工具也常用于对 mAb 免疫原性风险进行临床前预测。这些包括HLA结合测定、DC相关测定、T细胞刺激测定、PBMC刺激测定和各种动物模型。HLA 结合和 DC 抗原呈递测定可以评估源自 mAb 的潜在 T 细胞表位，而 T 细胞和 PBMC 刺激测定则检查 mAb 是否可以在细胞增殖和细胞因子释放方面在体外和离体激活免疫细胞。例如，英夫利昔单抗和利妥昔单抗可变区中的 T 细胞表位能够刺激外周血单核细胞 (PBMC) 分泌多种细胞因子。在另一项研究中，通过检查 T 细胞增殖来评估苏金单抗（一种用于治疗斑块型银屑病的抗白细胞介素 17A 单克隆抗体）的免疫原性。
这些实验工具在评估和预测免疫原性方面都有局限性。虽然被认为可靠且简单，但大多数实验测定都是劳动密集型的，并且对大量候选单克隆抗体实施是不切实际的。
5.2 临床环境处理
早期准确的 ADA 检测对于接受 mAb 治疗的患者是极其重要。ADA 检测需要为临床医生提供足够的信息来监测治疗并确定最佳干预策略。由于药物和分析物都是抗体，因此针对治疗性单克隆抗体检测 ADA 非常具有挑战性。此外，由于患者血清中存在药物和免疫复合物，免疫测定很容易出现偏差。从历史数据来看，对 mAb 给药后的反应和 ADA 患病率的研究一直不一致，部分原因是临床试验中用于监测免疫原性的各种测定形式。 FIg2 显示了影响 ADA 精确测量的竞争因素。
基于 ELISA 的桥接测定是最常用的 ADA 测定方法之一，其中 mAb 药物首先用于捕获患者血清中存在的 ADA，然后通过添加额外的标记 mAb 作为辅助探针来检测后者。桥接 ELISA 检测用于多种 mAb 的 ADA 检测，其中一些检测包括加酸的步骤以将 ADA 与 mAb 分离。然后捕获或去除过量的 mAb，并可以检测到游离的 ADA。这些测定通常具有明显较高的背景，并且由于抗体解离而导致灵敏度较低。桥接检测也可能导致假阴性，因为它们更有可能“错过”免疫反应早期阶段存在的低亲和力 IgM ADA。大多数基于 ELISA 的桥接测定也对 mAb 的低谷水平（采样时循环 mAb 的水平）敏感。ADA 和 mAb 往往会形成高分子量免疫复合物，使 ADA 检测更具挑战性。
在临床环境中，评估患者血清中的 ADA 水平以及评估干扰 mAb 生物和临床活性的中和抗体的存在非常重要。ADA 的中和作用可以通过测试血清中的 ADA 是否抑制 mAb 与其靶标的结合来测定。
5.3 免疫原性降低
降低免疫原性的临床方法包括主动干扰 T 细胞对 mAb 的反应，从而诱导免疫系统的个体耐受性（“耐受化”）。例如，甲氨蝶呤 (MTX) 与英夫利昔单抗联合使用可减少 RA 患者中 ADA 的形成 。当与硼替佐米（一种导致细胞死亡的蛋白酶体活性抑制剂）一起服用时，MTX 还可以逆转接受利妥昔单抗治疗的婴儿庞贝病患者的高 ADA 水平。硫唑嘌呤也是一种免疫抑制药物，可以与英夫利昔单抗或阿达木单抗联合使用，以改善治疗并减少免疫原性和 ADA 形成。然而，这种非特异性免疫抑制方法具有潜在的有害副作用，必须与患者的整体治疗计划相平衡。
6 汇总
mAb 具有治疗多种疾病和病症的潜力，但它们可能具有高度免疫原性并诱导不良的 ADA 反应。ADA 可以通过改变 mAb 的生物利用度和/或加速循环清除来降低 mAb 药物的功效。虽然 ADA 生成的分子机制尚未完全了解，但它取决于患者和药物的特征。虽然早期 ADA 与小鼠来源有关，但 ADA 也针对完全人源的 mAb。事实上，完全人源化不能彻底消除 mAb 免疫原性和 ADA 形成。ADA 产生的原因和方式还取决于报告的免疫原性率的差异，这强调了 ADA 检测标准化临床测定的必要性。了解ADA的生成机制以及影响 mAb 免疫原性的主要因素将有助于我们设计出更安全、药物排斥率更低的mAb。
7 参考文献
[1] Vaisman-Mentesh, Anna , et al. "The Molecular Mechanisms That Underlie the Immune Biology of Anti-drug Antibody Formation Following Treatment With Monoclonal Antibodies." Frontiers in immunology 11:1951.
[2] Vaisman-Mentesh, Anna , et al. "Molecular Landscape of Anti-Drug Antibodies Reveals the Mechanism of the Immune Response Following Treatment With TNFα Antagonists." Frontiers in Immunology 10(2019):2921.
[3] http://www2./news/743211
