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人教版高中新教材《生物学 ·选择性必修3 · 生物技术与工程》新增了DNA 片段的扩增及电泳鉴定的内容。但教材受篇幅所限，只对凝胶电泳的原理和过程进行了简略的介绍，对某些具体问题并未进行深入阐释。凝胶电泳实验需要用到电泳仪、电泳槽等仪器和溴化乙啶(EB)、载样缓冲液等试剂，目前大部分高中学校尚且不具备开展该实验的条件。因此，一些师生对凝胶电泳实验的原理、常用试剂的作用、凝胶电泳的类型等问题存在疑惑。本文按照相关问题在教材中出现的先后顺序进行分析，以帮助教师和学生加深对相关实验原理的理解。教材P.84提到：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动[1]。但教材中并未说明凝胶电泳中DNA分子所带电荷的种类。因此，学生并不清楚凝胶电泳中DNA分子会向哪种电极移动。DNA具有可解离的酸性和碱性基团，在溶液中会发生解离而带电。溶液的pH不同，DNA带电情况也不相同。当溶液的pH达到某种物质的等电点(pl) 时，该物质所带净电荷为零，呈电中性。一般而言，碱性溶液的pH大于pl,物质带负电荷，在电场中会向正极移动；而酸性溶液的pH小于pI,物质带正电荷，在电场中会向负极移动。DNA 分子的pI在4～4.5之间，而琼脂糖凝胶电泳常用缓冲液的pH一般在6～9之间，此时，缓冲溶液的pH大于DNA的 pI,DNA带负电荷。因此，在凝胶电泳时DNA分子会由负极向正极移动。在实验过程中，需要注意凝胶放置的方向，应该把带有加样孔的一端靠近电泳槽的负极，以便DNA分子从加样孔处向正极移动。教材P.84 提到：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。那么，这些因素是如何影响迁移速率的呢?从红色海藻产物琼脂中提取出来的琼脂糖是一种常用的电泳介质。琼脂糖是由D- 吡喃半乳糖和3,6-脱水-L- 吡喃半乳糖交替连接而成的一种线性多聚合物。标准琼脂糖通常在85~ 95 ℃时熔化，经冷却至35～42 ℃时可以制成凝胶。制成的琼脂糖凝胶是一种带孔的筛网状多聚物。琼脂糖浓度会影响凝胶筛孔的大小，进而影响DNA分子的迁移速率。凝胶浓度越小，筛孔越大， DNA 分子迁移速率就越高；凝胶浓度越大，筛孔越小，DNA 分子迁移速率就越低。DNA 分子的大小也会影响迁移速率。当凝胶浓度相同时，较大的DNA 分子因体积大，所占据的空间大，在穿过凝胶孔隙时会遇到较大的阻力，穿 过孔隙相对困难，迁移速率低。反之，迁移速率就高。电泳一段时间后，较大的DNA 分子迁移距离小，离加样孔近；而较小的 DNA 分子迁移距离大，离加样孔远。相同大小的DNA 分子则会聚集在凝胶同一特定的位置上。根据这一特性，可以把不同 大小的DNA 分子分离开来(图1)。分子大小相同但构象不同的DNA 片段，迁移速率也不相同。例如，pUC19 质粒3种构象的迁移速率不尽相同。超螺旋的共价闭合环状质粒DNA (cccDNA) 有效体积小，穿过凝胶孔隙时遇到的阻力小，迁移速率快。当共价闭合环状质粒DNA 的两条链断裂后形成线状DNA(LDNA) 的构象，迁移速率较慢；当共价闭合环状质粒DNA的1条链断裂时，会形成开环质粒DNA(ocDNA) 的构象，迁移最慢[3]。除了上述影响因素外，凝胶类型和电场强度等因素也会影响DNA分子的迁移速率。DNA 分子本身没有颜色，怎样才能在电泳结果中观察到呢?教材P.85提到：制胶时，稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀[1]。常用的核酸染料有哪些呢?核酸染料是如何发挥作用的呢?由于 DNA 分子本身没有颜色，需要将电泳结果用核酸染料处理后放在紫外线投射仪等特定仪器下才能观察到。EB是一种实验室常用的核酸染料，它是一种扁平分子，其化学结构如图2所示。EB可插入DNA 双链相邻碱基之间(图3)形成EB- DNA 复合物，该复合物在紫外线激发下发射出红橙色荧光。发出的荧光一部分来自EB 吸收的紫外线能量，另一部分来自核酸吸收后传给EB 的紫外线能量，而且EB结合在核酸碱基对之间的疏水环境大大增加了荧光产率[3]。EB-DNA 复合物荧光强度与DNA含量成正相关，根据荧光强度可粗 略估计样品DNA 的含量。EB 作为核酸染料具有操作简单的优点。EB不与琼脂糖凝胶结合，只有DNA 分子能吸收EB 并发出荧光，因此无须洗去凝胶中游离的EB, 即可检测DNA 条带。尽管EB 具有染色效果好、操作简单等优点，但其是一种致癌物质，在实验操作时一定要戴好手套，避免直接接触。目前，一些实验中会使用Goldview等毒性小的新型核酸染料替代 EB, 其灵敏度与EB 相当，使用简便，但价格较高。电泳时阳极与阴极都会发生电解反应，引起阳极和阴极的pH发生改变。如何使电泳系统的pH保持相对稳定呢?教材P.85 提到将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1 mm 为宜。那么，电泳缓冲液的成分是什么?电泳缓冲液维持电泳系统pH 稳定的原理是什么?电泳缓冲液还有其他的作用吗?电泳时阳极与阴极都会发生电解反应，阳极发生氧化反应，阴极发生还原反应，长时间的电泳会使阳极变酸、阴极变碱，加入电泳缓冲液可以维持电泳系统pH的相对稳定。电泳缓冲液是指在进行凝胶电泳时所使用的缓冲溶液，是凝胶电泳系统的一个重要组成。常用的核酸电泳缓冲液有Tris- 乙酸(TAE) 和 Tris-硼酸(TBE), 这两种缓冲液都含有Tris碱和EDTA (乙二胺四乙酸),主要区别在于酸的成分不同。两种缓冲液在电泳中的作用相同，但各有优缺点：TAE 分辨率高，但缓冲能力弱，不能长时间使用，需要经常更换；TBE 分辨率略低， 但缓冲能力强，可以反复使用。电泳缓冲液可以使溶液具有一定的导电性，有助于DNA 分子的迁移。Mg2+是DNA酶的激活剂，电泳缓冲液中的EDTA是一种螯合剂，能与Mg2+ 等二价金属离子结合，可防止电泳时DNA 被降解。DNA 分子没有颜色，如何观测电泳进程呢? 加样时，样本是否会飘散在电泳缓冲液中?教材 P.85 提到：将扩增得到的PCR 产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。那么，凝胶载样缓冲液是怎样起指示作用的?它又是如何解决样品飘散问题的呢?凝胶载样缓冲液是在加样之前与待电泳的样本相混合的一种缓冲液。琼脂糖凝胶电泳用到的载样缓冲液(DNA loading buffer)主要由溴酚蓝、二 甲苯青FF、Tris-HCl、甘油或蔗糖等组成。溴酚蓝和二甲苯青FF是两种在电场中以预知速率向正极泳动的染料。琼脂糖凝胶浓度在0.5%～1.4%的范围内，以0.5×TBE 作电泳液时，溴酚蓝呈现蓝紫色，与长300 bp 的双链线状 DNA 的迁移速度相 同，而二甲苯青FF呈现蓝色，与长4 kb 的双链线 状DNA 的迁移速度相同。这两种指示剂能够分别显示300 bp DNA 和4 kb DNA 的电泳进程，指示终止电泳的时间。在电泳时，当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1～2 cm 处，要停止电泳。染料的另一个作用是使样本呈现颜色，完成加样的加样孔呈现蓝色，未加样的加样孔为无色，从而使加样操作更加便利。若样品密度较小，容易流入附近加样孔，会造成交叉污染，影响结果的分析。缓冲液中含有的甘油或蔗糖成分能够增加样品密度，保证每个样品更容易沉入各自的加样孔，防止飘散进入其他加样孔。电泳结束后，如何判断样本中是否含有待测DNA 分子?如何确定待测 DNA 分子的大小及含量?教材P.85提到：上样时会留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。标准参照物是什么? 它如何指示分子大小?这些问题教材并未说明。凝胶电泳时用到的标准参照物是 DNA 标记 (DNA Marker),它含有若干组碱基对数目已知且具有一定梯度变化的DNA片段。DNA Marker和样本 DNA同时进行凝胶电泳，通过对比两者的迁移速率，可以大致估计样本DNA 的大小。为了使 估计结果更加准确，在凝胶电泳时尽量选择在目标片段大小附近梯度较为密集的DNA Marker。借助DNA Marker除了能够估计样本DNA 的大小之外，还可以通过对比条带的亮度，粗略估计样品中DNA的含量。以一份电泳结果(图4)为例，该电泳图显示的是检测含有查尔酮合酶基因pMD19-T质粒是否成功转入大肠杆菌DH5。M对应的加样孔中加入的是DNA Marker,其内含有6种分子大小不同的DNA片段，在电泳图上呈现出6个条带。1～6加样孔中加入的是6个菌落的PCR 产物。已知目标DNA 约为700 bp。通过分析可知，6个菌落均成功扩增出了查尔酮合酶基因片段，目标质粒成 功转入大肠杆菌。条带1比条带6略窄一些，因此，条带1中DNA含量较少。除了以上6个实验细节的疑惑，学生还提出了 两个问题：分离DNA和蛋白质都可以用琼脂糖凝胶电泳吗?为什么有些电泳装置是水平的，而有一些电泳装置是垂直的?凝胶电泳有琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和脉冲电场凝胶电泳3种类型。上文中介绍的琼脂糖凝胶电泳分辨的DNA 长度范围广，能够分辨0.2 kb～50 kb之间的DNA 片段，但分辨率低，只能区分相差100 bp 以上的 DNA 分子。琼脂糖凝胶电泳采用水平方式进行电泳。要分辨长度差距较小的DNA 片段，需要借助聚丙 烯酰胺凝胶电泳，它可以分辨大小只相差1 bp 的 DNA 分子，但其分辨的长度范围比较窄，在1～1000 bp 之间。聚丙烯酰胺凝胶电泳采用垂直方式进行电 泳。聚丙烯酰胺凝胶是一种在催化剂作用下由 丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺聚合而成 的人工合成凝胶。聚合时，由单体丙烯酰胺聚合成链状物，由交联剂甲叉双丙烯酰胺将链与链交联成网状，形成三维网状结构的不溶于水的凝胶。聚 丙烯酰胺凝胶电泳除了用于分辨 DNA 以外，还常用于蛋白质的分离，如SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的一种分离蛋白质的技术。普通的琼脂糖凝胶电泳一般不能分离分子大小在50 kb 以上的DNA分子。因为DNA 分子在凝胶介质中呈无规卷曲的构象，当大分子DNA通过比自身直径小的凝胶筛孔时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向拉伸,从凝胶前后相邻的孔隙中蠕动通过，此时大分子DNA 之间的迁移速率十分接近，难以分离开来。显然，要分离50 kb 以上的大分子 DNA 或染色体DNA, 用普通的琼脂糖凝胶电泳已经无法达到分离目的了。脉冲电场凝胶电泳可以很好地解决这一问题。脉冲电场凝胶电泳也是以琼脂糖作为凝胶介质，与普通琼脂糖凝胶电泳的主要区别在于通过交替用两个垂直方向的不均匀电场,DNA 分子在凝胶介质中的泳动方 向会随电场方向的周期性变化而不断发生改变，如 图5所示。DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需要的时间显著地依赖于分子大小。DNA 分子越大，在每个脉冲时间内，重新定向占用 的时间越长，用于朝新方向泳动的时间越少，在凝胶中迁移速率越低，从而实现对超大DNA 分子的分离。应用脉冲电场凝胶电泳，可分离大小高达10⁷bp 的 DNA 分子,该类型的电泳多采用水平 方式进行。以上3种电泳类型在凝胶介质种类、电泳方 式、DNA分辨范围等方面存在一定的差异，可根据实际需求进行选择。[1]刘兆霞,张顺仓.探讨凝胶电泳实验中7个疑难问题[J].中学生物教学,2022,(22):50-53.
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