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15 分子生物学筛选 分子生物学的发展，不断推出新的技术，有助于筛选参与重要生物学功能的基因，从而进一步揭示分子机理。 可以是通过增加基因功能，来发现有某种功能的基因，也就是gain of function (GOF)的筛选，如根据基因表达时间、空间来发现，可以有多种“表达克隆”的方法。也可以通过降低基因的功能，来发现参与某种功能的基因，loss of function (LOF)的筛选。GOF有助于发现对于功能充分的基因，LOF发现对功能必要的基因。 本章以一些重要的例子来说明这些方法及其应用。 15.1 按表达时间找基因 （见： ） 15.2 按表达空间找基因 根据基因表达的空间，也可以寻找基因。 如第五章所述，脊椎动物如两栖类的胚胎早期，与卵母细胞一样，有动物极和植物极。两者不仅外观着色可以不同，而且如果受精后会成为不同的胚胎部分，植物极的细胞还向动物极的细胞发出分子信号，例如在动物极与植物极之间的边缘区产生中胚层及其衍生的组织细胞(Nieuwkoop, 1969; Nieuwkoop and Ubbels, 1972)。  哈佛大学Douglas Melton实验室决定专门寻找卵细胞植物极和动物极特异的mRNA。他们用卵细胞的mRNA，反转录为cDNA，制成含量2x106的cDNA文库 (Rebagliati et al., 1985)。他们切下动物极和植物极，分别制备mRNA，然后做32P标记的探针。用这些探针分别与卵细胞cDNA文库的模板杂交，寻找两极特异的mRNA。他们找到3个动物极特异的mRNA (分别命名为An1、An2、An3)和一个植物极特异的mRNA (Vg1)。他们进一步分析Vg1，发现它编码一个分泌性的蛋白质，属于转化分化因子(TGF-b)家族(Weeks and Melton, 1987)。
(图片来自饶毅：生物学概念与途径）
（图片来自Rebagliati, Weeks, Harvey and Melton, 1985) 如第五章所述，胚胎发育的一个重要过程是形成腹背轴。两栖类的背轴含很多结构。虽然背轴在比较肠胚期才比较容易从外观看见，但其决定却在很早，例如爪蟾胚胎可能在受精过程因为精子进入位点就确定了其对侧为背侧(Gerhart et al., 1989)。寻找可以决定背轴的基因的一个方法是到早期胚胎的背侧去找有背唇化功能的基因。已知用紫外线(UV)处理1细胞期的爪蟾胚胎可以导致胚胎的腹侧化(Gimlich and Gerhart, 1984)，而用氯化铝(LiCl)处理1细胞期的爪蟾胚胎可以导致胚胎的背侧化(Kao, Masui and Elinson, 1986)。  美国伯克利加州大学的Richard Harland与博士后William Smith从不同胚胎提取mRNA，注射到UV处理过的胚胎，检测它们能否让腹侧化的胚胎背侧化(形成背轴) (Smith and Harland, 1991)。他们比较了几种来源的mRNA，发现作用最强的是LiCl处理过的胚胎来源的mRNA(成功率46%)，其次是正常胚胎来源的mRNA(成功率12%)，而腹侧化胚胎来源的mRNA具有的背侧化作用(成功率8%)类似于没注射mRNA的对照(成功率5%)。他们按分子量将作用最显著的mRNA分成几个组分，其中从组分8获得一个mRNA有背侧化作用，编码Xwnt8，但当时已经有人发现同类基因(Smith and Harland, 1991)。他们从组分9获得一个全新的基因，编码一个分泌性蛋白质，他们命名为Noggin (Smith and Harland, 1992)。Noggin最早表达在肠胚刚刚开始形成时期，而且在背唇。以后也在神经管中。这是第一个发现特异表达在背唇的基因。功能上，它不仅能够背侧化早期胚胎，而且可以有神经诱导作用。
(图片来自Smith and Harland, 1992)  美国洛杉矶加州大学的Eddy de Robertis实验室专门用背唇制备cDNA文库，然后注射mRNA，来寻找可以背侧化UV处理后胚胎的基因。他们发现Chordin (Sasai et al., 1994)，它也先表达在背唇，以后在神经管，并且也有神经诱导作用。
(图片来自Sasai et al., 1994) 参考文献 Nieuwkoop PD (1969). The formation of the mesoderm in urodelean amphibians. I. Induction by the endoderm. Wilhelm Roux’ Archieve of Developmental Biology 162:341-373 Nieuwkoop PD, Ubbels GA (1972). The formation of the mesoderm in urodelean amphibians. IV. Qualitative evidence for the purely “ectodermal” origin of the entire mesoderm and of the pharyngeal endoderm. Wilhelm Roux’ Archieve of Developmental Biology 169:185-199. Rebagliati MR, Weeks DL, Harvey RP, Melton DA (1985). Identification and cloning of localized maternal RNAs from Xenopus eggs.Cell 42:769-777. Weeks DL and Melton DA (1987). A maternal mRNA localized to the vegetal hemisphere in Xenopus eggs codes for a growth factor related to TGF-b. Cell 51:861-777. Gimlich RL, Gerhart JC (1984). Early cellular interactions promote embryonic axis formation in Xenopus laevis. Developmental Biology 104:117-130. Gerhart J, Danilchik M, Doniach T, Roberts S, Rowning B, Stewart R (1989). Intracellular signaling centers: their establishment and modes of action. Development 107:37-51. Kao KR,Masui Y and Elinson RP (1986). Lithium-induced respecification of pattern in Xenopus laevis embryos. Nature 322:371-373. Smith WC and Harland RM (1991). Injected Xwnt-8 RNA acts early in Xenopus embryos to promote formation of a vegetal dorsalizing center. Cell 67:753-765. Smith WC and Harland RM (1992). Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell 70:8129840. Sasai Y, Lu B, Steinbeisser H, Geissert D, Gont LK and De Robertis EM (1994) Xenopus chordin: a novel dorsalizing factor activated by organizer-specific homeobox genes. Cell 79:779-790. 泪水与拥抱饶议科学 2023-04-12 08:01 每个人的感情范围和流露程度不同。 杨振宁先生的长子在一个录像中说，如果一般人的感情范围是2到8，我父亲只有4到6。也许就是中文形容的“平静如水”？ 1991年至1994年，我在哈佛的博士后导师Douglas Melton（莫尔顿），属情绪表露很少的人。 昨天，也就是2021年11月27日，《纽约时报》报道莫尔顿，引用他的最后一句话是：很多泪水和拥抱。
比较出人意料。 训练有素的学者 1953年，莫尔顿出生于芝加哥北郊。 1975年，莫尔顿毕业于伊利诺大学香槟分校（UIUC）。 以上似乎看不出特别，但他于1975年入选马歇尔学者，从此记录非常突出。  英国有两个美国人最难入选的奖学金：1903年开始的罗兹学者，和1953年开始的马歇尔学者。 罗兹学者历史悠久，好像需要参议员推荐，每州每年两人，但只能在牛津大学读书。入选的有年轻时的克林顿等。华人可能第一位罗兹学者是钱学森的堂侄钱永佑（Richard Tsien，生理学家，原斯坦福大学生理系主任、纽约大学神经科学研究所所长）。 罗兹学者近年进入中国，好像是一些奇特的方法遴选，其中学者很少参与遴选，选的似乎也是能说会道为主。 马歇尔学者是英国感谢美国国务卿乔治·马歇尔发起的马歇尔计划对于欧洲二战后重建的功劳。钱学森的堂侄钱永健（Roger Tsien）有可能是华人第一位马歇尔学者。马歇尔学者可以在英国多个大学，比较多选择的是剑桥。 莫尔顿于1975至1977获剑桥的科学史学士，其后跟John Gurdon做研究生，1980年分子生物学博士。Gurdon主要是研究胚胎发育，2012年诺贝尔奖。 英国的教育，对个性平静的人，特别显效，会显得特别聪明。（当然性格不匹配的，学起来就很奇怪。曾经碰到一位西班牙人，他学英国的做派，并用双重否定，听者老觉得有个西班牙人穿了英国外衣。） 有人怀疑，诺贝尔奖委员会给Gurdon发奖，有一个因素是很多人认为Gurdon很聪明，想方设法给一个奖。Gurdon的研究是五十年代末。2006年日本的山中伸弥研究干细胞的因子后，有人把他们两人组合起来。山中伸弥的研究，听上去意义很大，但作为应用，不要说在2012年还太近，就是今天也仍然难以说清楚落地的情况。而那些因子，并非内源的生理需要。所有，如果没有Gurdon年龄的迫切，恐怕没有很好的理由不能让山中伸弥的奖等上十几二十年。 莫尔顿在英国的教育，一方面使他在刚刚兴起的分子生物学技术方面有非常好的训练，一方面也开始用了蛙的卵母细胞，因为蛙卵是Gurdon一辈子使用的样本。而且，莫尔顿与英国式的交流模式很相容。 莫尔顿的研究中有多个非常突出的成就。但因为有英国模式，有时不突出的研究也让人感到聪明。我自己就是因为听他讲学术报告，觉得他非常聪明，而申请他实验室做博士后。但一旦进入领域，很快发现我听他的那次，其实讲的内容虽然在Nature发表（341：33-38），研究的意义并不大，只是能够讲故事、发文章。这篇文章对于科学毫无意义。当然，莫尔顿并非长期追求这类，而是年轻时也偶有这样的文章，不像今天的海内外华人生物学家，追求讲故事而不在乎科学意义的文章遍地都是，而且不以为耻、反以为荣。 年轻有为的才俊 莫尔顿在分子生物学和发育生物学，都有杰出的成就。 在分子生物学，他最重要的可能是1984年发明SP6转录酶（Nuclear Acids Research 12：7035-7056）。SP6与T3、T7并列，是我们一般在体外转录使用最多的三个酶。 莫尔顿在发育生物学的第一个重要工作，是1985年发现特异表达在卵细胞一侧的mRNA（Cell 42：769-777）。发育生物学认为卵细胞及受精卵分子分布不均匀，而且两栖类的卵细胞“植物极”可能有信号指导其他部位的发育。莫尔顿用差减的方法，找到了植物极特异的mRNA，他们命名为Vg1。这一基因可能参与胚胎发育，而其表达的图，漂亮到很多人过目不忘，我长期用于讲课。
莫尔顿揭示神经诱导的分子机理。他和博士后于1994年发表两篇Cell文章，提出神经诱导是抑制去抑制的过程（Cell 77：273-281，Cell 77：283-295），改变了此前人们对于诱导的简单看法，教科书为此改写。 莫尔顿于28岁任哈佛大学生物化学和分子生物学系助理教授，31岁任副教授，35岁任教授，42岁当选美国科学院院士，46岁任哈佛讲席教授。 他实验室的力量很强。我在的那些年，以及之前，他的博士后都是自带经费，不需实验室发工资。他的博士后，有冯诺依曼的外孙、诺奖得主的弟弟。现任哈佛医学院遗传系主任Cliff Tabin是他以前的博士后，年龄只小他一岁。 莫尔顿创办哈佛大学干细胞研究所，大家认同。但他推动成立干细胞系，有很大争议。反对方认为干细胞不宜成为系，有些人因此离开哈佛。 产业应用的成效 莫尔顿的SP6有专利，并以此开始生物技术创业。 莫尔顿的创业或参与创业，真正用他自己发明的技术和自己的科学专长，而不仅用自己的名誉。 他的企业有多个，其中两个很引人瞩目。 1987年，他与其他两位科学家、一位年轻的医生，创立了Gilead（吉利德）。这一企业，是他们三位科学家专长的反义RNA为技术支撑，而年轻的医生直接投身管理企业。吉利德的这一技术后来效果不好，1995年把技术卖了。但吉利德坚持两点：1）不卖自己，2）传染病领域。 西方大多数生物技术企业，其目标就是卖个好价钱，卖给大药厂。这一做法，与美国和西方金融界在生物医药产业的做法有关。1970年代以来，很多药厂是被金融杠杆逼迫而兼并。兼并可以看上去很快降低成本，增加体量，给金融投资带来立即的回报，但实际推动作用微乎其微。是没有进步情况下金融界给自己设计的赚钱方法。如果没人敢于突破，就显得是正确的，如果有人不信邪，这种自私的设计就不一定站得住。 吉利德坚持卖艺不卖身，相信自己。虽然它也曾眼花，但基本坚持在传染病，特别是病毒性传染病深耕，才能创造奇迹。2011年11月，吉利德以110美金收购一个不到一百人的团队，后者每年亏损8、9千万美金，而要价奇高。与吉利德竞争的是大药厂，而大药厂只出价70亿美金。吉利德敢于以小博大，敢于开出高价，是因为它对于病毒性疾病有深刻的理解，而不像大药厂貌似委员会人人有投票权、不懂行也可以言之凿凿、而不需要特别负责。 吉利德收购Pharmasset之后，一年之内其收购部门的药物得到美国药监局（FDA）的批准，24个月销售收回全部成本。这个药物，不仅是企业的奇迹，而且是病毒药物的奇迹：有效率极高，有人形容是吃一个好一个。 吉利德推出第一个新冠病毒治疗的药物，虽然疗效有限，但它来自吉利德也是有背景的。 子女患病的痛苦 莫尔顿的女儿Emma出生于1987年。 儿子Sam出生于1991年。 Sam半岁被发现患糖尿病。 当时风华正茂的莫尔顿，非常难过。 他决定转向。 他的实验室逐渐开始研究胰腺发育，后转为专攻胰岛干细胞。 等我们这批博士后也研究生离开后，莫尔顿实验室再招收的人都做胰腺。 莫尔顿的女儿14岁时，也患糖尿病。 一型糖尿病发病最早的是13岁左右，而半岁发病的极为罕见。一般来说，非常难以到成年。  莫尔顿和夫人通过艰难的努力，让子女成长。 Sam是哈佛数学系的本科生，现在是研究生。 Emma毕业于华盛顿大学法学院，现在是Boston一家医院的律师。 投身治疗的曲折 莫尔顿多方面努力。 他多次在公众场合，包括美国国会，力促有助于科学研究的政策。例如，右派的小布什政府禁止政府经费资助胚胎干细胞研究，莫尔顿据理力争。得不到政府支持，他就另开实验室，用私人机构的经费，制造出人胚胎干细胞免费提供给全世界的研究人员。 他实验室研究如何制造能够分泌胰岛素的beta细胞。这一过程，也历尽艰辛。其中，2013年一篇Cell文章，后来撤稿，成为广为报道的新闻。这是他几十年研究生涯唯一一次遭遇如此羞辱。但是，与我国目前绝大多数死不认错、甚至对于批评者倒打一耙不一样，莫尔顿不是掩盖、更不是抵赖，而是与批评者合作，之后发现确实是自己实验室出了错误， 2017年公开撤稿。 莫尔顿带领实验室继续努力。 2014年，他们实验室在Cell发表一篇论文，发明用人类干细胞制造beta细胞的方法（Cell 159：428-439），在老鼠糖尿病模型有效。 他成立了公司，以子女命名：Semma。 公司的技术推进，令另外一家公司大感兴趣。2019年，Vertex公司以9.5亿美元收购Semma。 Vertex收购后，继续推进，并应用于病人。 2021年11月27日，《纽约时报》报道第一个病人的效果。这是一个因为患病而难以维持工作和生活的病人（Shelton）。病人被工作单位辞退，而前妻因为太同情他，而收留，让他不要出门，因为经常突然患病倒地、撞墙，等等。 Shelton用了莫尔顿实验室发明，经过Semma和Vertex推进的beta细胞后，Melton本人不知道效果如何。所以，当Vertex要给他报告的时候，他认为大概效果不佳，需要他再鼓励Vertex公司的人，争取他们继续努力。 结果，Shelton的效果出奇的好。 莫尔顿不仅喜笑颜开，而且回家告诉妻子、子女。这样就有题目那句话，他避免说细节，就说，“有很多泪水和拥抱”(let’s just say there were a lot of tears and hugs”。 病人Shelton说自己出院后看到检验结果哭了。“我只能说'谢谢您’”（ “the only thing I can say is 'thank you’ ”）。 任重道远的医疗 各种疾病影响很多病人，我们没有人敢说自己一生不会生病。 各种疾病影响很多家人，我们一般都有亲友患病。 各种疾病影响人类社会，不分地域、人群、国家，我们都受影响。 社会经济状况的提高，生活环境的改善，是疾病减少的一个重要原因。 疫苗的发明，是减少疾病的第二大原因。 抗菌药物的发明，是减少疾病的第三大原因。 其他各种药物和治疗方法，也有贡献。 但是，众所周知，还有很多疾病，我们难以治疗，有些甚至束手无策。 我们需要更多的科学，更好的技术，逐渐解决现有的疾病。 干细胞技术，能否根治糖尿病，目前还不能定论，能否治疗其他疾病，一般也还没有落地，但有曙光初现令人重燃希望。 基因相关技术，突飞猛进，在一些方面能够带来根本性改善，一些方面还需要很多科学家和技术人员的努力。 化学药物，仍然在很长时间是治疗的主流。 我国生物医药产业，在以毕井泉为代表的优秀政策制定者领导下，在各方面的推动下，第一次起飞。 虽然比美国相应晚了近50年，但终于第一次小起飞了。它还会出现上上下下的波动，但总体将越来越好。 我国的生物医药产业，从引进、吸收、合法收购、仿制为主的今天，也终将逐渐走向真正创新为主的道路。 我国科研人员，也不会永远只被金融和资本牵着鼻子，而终将迎来科学支撑我国生物医药产业的时代，逐渐改善越来越多我国病人的健康、提高家庭的幸福、社会的安定、国家的发展、人类的进步。 饶议科学 2021-11-28 |
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