疫苗制备工艺 mRNA疫苗/重组蛋白亚单位疫苗

mRNA疫苗

      mRNA疫苗是通过特定的递送系统将表达抗原靶标的mRNA导入体内，在体内表达出蛋白并刺激机体产生特异性免疫学反应，从而使机体获得免疫保护的一种疫苗。mRNA制备工艺如图1：提取表达抗原的mRNA，在经反转录得到表达抗原的DNA,把此DNA进行PCR扩增，扩增后进行基因重组，重组进质粒中，将质粒转化进大肠杆菌中，随着大肠杆菌的高密度发酵制备出携带目的DNA的质粒，大肠杆菌发酵后，经菌体收集，菌体裂解，裂解液澄清，在经三步层析法纯化出纯净的质粒DNA，得到的质粒经限制性内切酶将目的DNA从质粒中切除下来，经纯化后就可得到纯净的目的DNA，用逆转录酶将DNA体外转录成mRNA,转录翻译后用 dT 亲和层析填料纯化mRNA,纯化的mRNA进行LNP包被就完成mRNA疫苗的制备。

mRNA疫苗制备工艺

 1.scDNA制备，参考DNA疫苗制备

2.mRNA制备

制备的scDNA，经酶切得到线性化的DNA，在经阴离子交换层析DEAE Large Scale HP或者Seplife LXMS 30Q分离纯化得到目的DNA,DNA在转录酶的作用下，将DNA转录成mRNA如图10.

图10：在转录酶作用下DNA转录成mRNA

转录后再经Seplife Oligo dT 亲和层析纯化，纯化后在加帽酶的作用下，mRNA经过加帽反应，反应后再次经Seplife Oligo dT亲和层析纯化，即完成了mRNA的制备，mRNA在经LNP包被（如图11）就完成mRNA疫苗的制备。

图11：mRNA LNP包被

mRNA纯化

图12：蓝晓科技mRNA纯化工艺过程

Seplife Oligo dT是蓝晓科技自主研发的一种新型高刚性聚合物亲和填料，主要用于捕获mRNA。Seplife Oligo dT以聚苯乙烯为基质，具有均一的超大孔径，表面进行了特定的长链间隔臂修饰并键合了自主开发dT配基，具有较高的载量和特异性结合力，非特异性吸附低，可耐受高温（65℃）,现以广泛用于mRNA的纯化。

重组蛋白亚单位疫苗

将病毒的目的抗原基因构建在表达载体上，将已构建的表达蛋白载体转化到细菌、酵母或哺乳动物或昆虫细胞中，在一定的诱导条件下，表达出大量的抗原蛋白，通过纯化后制备的疫苗。

以新冠亚单位疫苗为例，解析蛋白疫苗制备工艺：

1.基因序列设计，克隆，发酵表达，收获抗原，澄清：略

2.RBD二聚体纯化工艺参考图13

图13：新冠亚单位疫苗纯化工艺

重组蛋白亚单位疫苗制备工艺，不同表达形式及不同aa序列纯化工艺相差较大，在纯化时可参考重组蛋白纯化思路和方法开发纯化工艺。