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8 月 20 日，印度宣布给予一款 DNA 新冠疫苗 ZyCoV-D 紧急授权许可，用于 12 岁以上人群的接种预防。 疫苗研发生产商 Zydus Cadila 称，根据此前临床试验数据，在印度本国主要流行毒株为 Delta 突变株的情况下，ZyCoV-D 预防有症状感染的有效率仍达到了 66%。 ZyCoV-D 不仅成为了第一款被批准的 DNA 新冠疫苗，也成为了全球首款应用于人类的 DNA 疫苗。 DNA 疫苗是什么？ 和 mRNA 疫苗一样，DNA 疫苗也属于核酸类疫苗（也被称为第三代疫苗/基因疫苗）。 全球大流行背景下，核酸类疫苗的发展有了显著提升。2020 年 12 月 3 日，英国卫生部门通过了 Pfizer-BioNTech 的 mRNA 新冠疫苗的紧急使用授权，创造了全球 mRNA 疫苗产业的新历史。 而与此同时，多款 DNA 新冠疫苗的研发也正在开展。根据 WHO 的统计数据显示，全球目前共有 112 款疫苗进入了临床阶段，其中包括 11 款 DNA 疫苗。 DNA 疫苗在原理上与 mRNA 疫苗非常接近，不需要从病原体中生产或者纯化蛋白来作为抗原，只要知道病原体的序列，就可快速设计生产出对应的疫苗，是一种设计非常高效的疫苗。 DNA 与 mRNA 疫苗最主要区别在于，mRNA 疫苗在进入人体后，可以利用人体自身系统生成病毒的关键蛋白作为抗原来诱发免疫系统反应，而 DNA 疫苗在进入人体以后，先利用人体的自身系统翻译出对应的 mRNA，然后再转录出蛋白质，以达到激活免疫系统的作用。 这样来看，和 mRNA 疫苗相比，DNA 疫苗还多了一个步骤。 但实际上，多的这个步骤，不仅没有让问题复杂化，反而还赋予 DNA 疫苗很多 mRNA 疫苗所不具备的优点。 首先，DNA 疫苗的载体为质粒，质粒可以直接进入细胞，而 mRNA 片段则无法做到。 DNA 质粒被导入宿主细胞后，表达外源蛋白抗原，这一过程与病毒感染相似，所以 DNA 疫苗能有效地激发体液免疫和细胞免疫，尤其是它能激活杀伤性 T 细胞。同时由于它能在体内较长时间的表达，所以可以进一步强化效应 T 细胞并增强免疫记忆。 其次，质粒本身是一段环形的 DNA，大小比 mRNA 片段要大且更稳定，可操作的空间更大，可以写下更多的遗传编码信息。 mRNA 疫苗像是一个只能写 140 个字的短微博，而 DNA 疫苗像是一个 2000 字的长文章。同样描述一件事情，肯定是 2000 字的长文章要更为详尽。 详尽的编码信息，帮助 DNA 质粒从容地生产全长病毒蛋白。这是因为在一些情况下，由于蛋白存在构象问题，只表达某一个片段无法诱发出良好的免疫反应。而 DNA 质粒生产的全长蛋白则可以完全还原病毒的蛋白，这是 mRNA 疫苗所不能做到的。 此外，由于质粒上可操作的空间比较大，所以还可以设计加入多个 DNA 片段，制备多价疫苗，也可以在质粒上增加额外的信号肽来促进蛋白表达或抗原提呈等多种功能。 昔日研发瓶颈 那么，这样一种优秀的疫苗技术，为何直到现在才上市了第一款疫苗呢？ 事实上，尽管 DNA 疫苗和 mRNA 疫苗相比看上去要更陌生，但它的研发历史却要比 mRNA 疫苗还久。 1993 年，DNA 疫苗首次被报告可用于预防病毒感染，随后，这个尚且稚嫩的概念就被业界誉为「第三代疫苗技术」。仅 2 年后，DNA 疫苗就获批用于治疗性艾滋病的临床；1996 年，FDA 也批准了 DNA 疫苗作为健康人预防艾滋病的临床 I 期试验。 但研发随后陷入瓶颈。 DNA 疫苗遇到的第一个致命问题，是「保护效力低」。 随着研发的一步步深入，科研人员发现，尽管 DNA 疫苗在小动物身上呈现了非常好的效果，但随着实验动物体型越来越大，免疫效力也开始越来越低，等到了人身上的时候，疫苗的效果已经很不明显了。 多年研究过去，DNA 疫苗在国际上陆续获批了不少动物疫苗。2018 年，我国在也批准了第一款用于动物预防 H5 亚型禽流感的 DNA 疫苗。但是，用于人的 DNA 疫苗却一直处在临床试验阶段，迟迟没有进展。  我国批准首个禽病 DNA 疫苗产品 图源：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 为了解决「保护效力低」的问题，研发人员想了很多办法。 比如最常见的增加剂量或者使用佐剂，从最早的维生素 D3，到随后的大肠杆菌伴侣蛋白（GroEL）等分子佐剂，都被认为可以有效的提升 DNA 疫苗的有效率。 除此之外，科研工作者还在递送方式上下了功夫。 传统的 DNA 疫苗采用针刺注射，主要依靠肌细胞来直接吸收质粒。为了提高质粒的吸收方式，科研人员对质粒的溶液进行了改进，比如与 mRNA 疫苗递送方式类似，DNA 疫苗在注射溶液里也采用了纳米颗粒或者脂质体的方式。 科研人员还在物理递送方式上尝试了很多有效的途径。其中最出名的就是基因枪和电穿孔。 基因枪也被称为生物弹道技术或微粒轰击技术。首先，DNA 质粒与金属颗粒结合，再通过高压气体释放时产生的力，将包裹了 DNA 质粒的金属颗粒「打入」人体，穿透目标组织的细胞，以此来传递质粒。 而电穿孔技术，则是通过针头注射递送 DNA 疫苗后，在注射部位施加电流，通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围介质中的外源分子。实验表明，皮内针头注射后的电穿孔递送可有效将 DNA 疫苗递送至多个细胞内隔室。 这些手段虽然显著的提高了 DNA 疫苗的效力，但结果还不能尽如人意，科研人员又提出了一个新的免疫思路：异源初免-加强。 通过大量的 DNA 疫苗实验我们发现，经过 DNA 疫苗进行初免，然后由重组蛋白疫苗或者是腺病毒载体疫苗等其他疫苗进行加强，可以获得较好的免疫效力。 由 DNA 疫苗启动的初次免疫，在 B 细胞和和 T 细胞方面 DNA 疫苗都有非常好的效果，在接下来由重组蛋白或者其他疫苗进行免疫加强，可以获得更好的效果。 DNA 疫苗能改写印度疫情吗？ 聊了很多基础知识，我们再回到这次印度获批的 DNA 新冠疫苗 ZyCoV-D。 从目前已经发布的 I/II 期临床数据来看，经过三针接种的受试者都没有发生严重的不良反应。同时，疫苗诱导出明显的体液和细胞免疫反应，血清中和抗体滴度与恢复期患者血清中的中和抗体滴度相当。 今年 1 月，印度批准了该国的首款新冠疫苗，为当地企业 Bharat Biotech 研发制造的灭活疫苗 Covaxin。而这次，印度对 DNA 新冠疫苗 ZyCoV-D 的批准则创造了世界历史。 印度为何选择 DNA 疫苗？可能的原因是考虑到价格问题，DNA 疫苗生产容易且存储方便。 首先，对于 DNA 疫苗，只要构建好合适的质粒，就可以通过生物发酵方法，以培养大肠杆菌（E.coli）的方式快速的生产。这个生产体系非常成熟，生产成本也非常低，而且大部分质粒，都可以用同样的一条生产线生产。 其次，DNA 疫苗运可以在室温保存，在普通的冰箱冷藏温度（4°）可以存放几年，甚至在高温都可以保存一段时间。这样的特征意味着，疫苗运输的过程中不需要冷链运输，普通的物流配送就可以实现。 根据印度公布的信息，ZyCov-D 可在 2～8℃ 下储存，并能在 25℃ 以下储存三个月的时间。这样一款新冠疫苗，对于拥有 13.9 亿人口而完全接种率刚刚达到 10% 的印度来说，或许将成为一款有力的武器。  印度新冠疫苗完全接种率 图源：Our World in Data 而在我国，国产 DNA 新冠疫苗 INO-4800 由艾棣维欣与美国生物制药公司 INOVIO 联合研发，去年 7 月已经在上海华山医院开展了 I 期临床试验。 从已公布的 I 期临床数据来看，INO-4800 具有良好的安全性和耐受性，且通过引发细胞或（和）体液免疫应答，在所有的受试者中都具有免疫原性。 在运输和保存方面，INO-4800 可在室温下保持稳定 1 年以上，在 37℃ 可保持稳定 1 个月以上，其在标准冷藏温度（2～8℃）下的设计保质期为 5 年，且在运输和储藏过程中无需冷冻。 在接种方式上，INO-4800 采用了电转仪进行电穿孔的递送方式，来增加 DNA 疫苗的效力，全程接种需要 2 针。 但根据已公布信息，印度这次获批的 ZyCoV-D 在质粒中加入了信号肽进行优化，同时使用 PharmaJetTropis 无针注射器，更多地强调了接种者的感受，但并没有提到是否采用了可以有效提高疫苗效力的接种方式。 在本国主流毒株为 Delta 毒株的情况下，ZyCoV-D 做到了针对有症状的核酸检测阳性保护率为 66.6%，重症保护率 100%。同时在受试者中还有 1400 名青少年，也同时验证了这款疫苗在 12～18 岁人群的有效性和安全性。  ZyCoV-D 的 I 期研究论文截图 但是，人们对于 DNA 疫苗的担忧依然存在。 第一，质粒在人体内存在时间较长，是否可能会出现 DNA 序列被整合到基因组之中？虽然质粒保存的位置不在细胞核内，但这方面仍在值得担忧。假如发生，可能会导致原癌基因活化或抑癌基因失活，有致癌的风险。 第二，DNA 进入体内，是否会诱发抗双链 DNA 抗体而引发免疫类的疾病（如系统性红斑狼疮等等）？再者，DNA 持续在体内表达外源蛋白，是否会出现免疫耐受？这些问题，仍需要更多数据和更久的时间来回答。 迄今为止，无论是动物实验还是临床试验，暂时都没有观察到这些情况，我们进行了大量的临床实验，就目前观察的结果，DNA 疫苗的安全性还是有保证的。 但是，这也是人类首次批准一种全新的技术。目前，印度已经启动了 ZyCoV-D 疫苗 III 期临床试验，共计纳入 2.8 万名受试者。 机遇和风险永远同时存在，让我们静待结果。（策划：z_popeye、gyouza） 致谢：本文经 中国疾控中心病原生物学博士 雷娜 专业审核 【注】 中国疾控中心病原生物学博士 雷娜 审核意见： DNA 疫苗是以 DNA 质粒为载体，将基因或基因片段导入宿主细胞的细胞核中，编码免疫原性抗原。 DNA 疫苗既有几个方面的优势： 1. 储存要求低：DNA 分子很稳定，可以常温、冷藏储存，便于运输和保存。 2. 生产成本低：DNA 接种（如质粒）可以在大肠杆菌内快速复制，便于扩大生产。 3. DNA 分子克隆比较容易，便于因病毒变异进行更新； 4. DNA 疫苗可以同时激活细胞免疫和体液免疫反应，而且质粒 DNA 的固有成分，CpG 未甲基化序列，可以激活固有免疫应答，从而增强对表达抗原的适应性免疫应答。 同时，DNA 疫苗也有一些不可忽略的风险值得进一步的研究证实： 1. DNA 序列是否被整合到基因组之中，长期表达？ 2. 质粒携带完整的 S 蛋白基因，表达出的 S 蛋白是否能与体内的ACE2受体结合，继而引发肾素-血管紧张素-醛固酮系统的作用变化？ 参考资料： 1.Silveira MM, Moreira GMSG, Mendonça M. DNA vaccines against COVID-19: Perspectives and challenges. Life Sci. 2021;267:118919. 2.Bourgonje AR, Abdulle AE, Timens W, et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), SARS-CoV-2 and the pathophysiology of coronavirus disease 2019 (COVID-19). J Pathol. 2020;251(3):228-248. |
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