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各位同学大家好，我是你们的超梦大师兄，今天我来为大家详细介绍一下细胞表型实验之一——克隆形成实验，话不多说，直接开始： 实验原理： （集落）克隆形成实验是测定细胞存活率和考察单个细胞增殖能力的有效方法之一。单个细胞在体外连续6代以上，其后代所组成的细胞群称为克隆或集落，这时每个克隆大小在0.3-1.0mm，含有50个以上的细胞，通过计数克隆形成率，可对单个细胞的增殖潜力做定量分析，常用的手段有两个：平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。 平板克隆形成实验主要适用于贴壁生长的细胞，软琼脂克隆形成实验常用于悬浮生长的细胞，某些恶性肿瘤细胞，不仅在贴壁状态下能增殖，在悬浮状态下也能增殖，其在软琼脂中形成克隆的能力反映了其恶性程度，这种方法可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。通过倍比稀释制备单细胞悬液，接种一定量的细胞经培养10-14天，具有增殖活性的细胞，一个细胞即形成一个集落，通过显微镜下计数，形成集落数与接种细胞数的比值即可反映细胞的增殖活性。 为什么要做克隆形成实验？ 1）检测细胞经干预后的克隆形成能力来判断干预后是否影响细胞的增殖和存活能力； 2）验证肿瘤细胞对药物、放疗等在增殖能力方面的敏感性; 3）评价细胞在体内成瘤性：肿瘤细胞不一定都可以在体内成瘤，如果体外克隆形成能力越强，即表明体内成瘤性越强，算是判断体内成瘤的模拟指标 一、 平板集落形成实验  1、实验试剂： 0.25%胰酶溶液，含10%胎牛血清的培养基，PBS溶液，结晶紫染色液或姬姆萨Giemsa染液，超纯水 染液配方： 10×Giemsa染色液：Giemsa粉末0.8g溶于50mL甲醇，完全溶解后加入50mL甘油，摇匀，37℃-40℃水浴8-12h，棕色瓶常温保存，用时取1份Giemsa原液溶于9份PBS中 0.1%的结晶紫染色液：称取1g结晶紫粉末，用甲醇定容到100mL，也可用PBS配置，避光常温保存 2、实验步骤（以6孔板为例） （1）制备细胞悬液：将对数生长期的单层细胞常规消化离心收集细胞沉淀。重悬细胞沉淀，计数，可倍比稀释至1×103个/mL （2）接种细胞：以每孔50、100、200个细胞的梯度密度接种六孔板中（根据细胞生长情况确定），补加培液3mL，置于培养箱中培养，静置2-3周，如果要加药处理的话，等到第二天贴壁就可以加药了 （注意：计数要准确，最好计3遍，取平均值；接种细胞时，一定要把细胞晃匀了；培养过程中要注意培养液的颜色，必要时中间可更换培液，要注意观察是否有污染） 关于计数这部分，很多同学都觉得头疼，这里我给出一张油管视频的截图，如果不知道该怎么稀释细胞悬液，可以参考这个方法：  https://www./watch?v=zPeY70vsHlk （3）染色：当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，停止培养，弃掉培液，用PBS小心洗涤2-3次，弃掉PBS。每孔加入甲醇1ml，固定15min，弃固定液。每孔加入1mL 0.1%结晶紫或Giemsa染色液染色10-30min，流水缓缓洗去染液，空气干燥 （注意：在培养过程中，可以隔两三天在显微镜下观察以下，如果大多数克隆均含有50个以上的细胞，这时就可以终止培养了） （4）计数：镜下计数含50个细胞以上的克隆数并拍照，取3个复孔的克隆平均值进行计算：  实验至少重复2次。 （注意！！实验成功的关键是单细胞悬液的制备和接种密度，细胞千万不能成团，接种密度也不能过大，否则会出现数个细胞克隆融合的现象；细胞克隆形成率差别较大，一般传代细胞系强于初代培养细胞克隆形成率，转化细胞系强于二倍体细胞克隆形成率，肿瘤细胞强于正常细胞克隆形成率） 实验结果图示例：  The long noncoding RNA SNHG1 regulates colorectal cancer cell growth through interactions with EZH2 and miR-154-5p. Mol Cancer. 2018;17(1):141. 二、 软琼脂集落形成实验  1、实验试剂： 0.25%胰酶溶液，含10%胎牛血清的培养基，PBS溶液，超纯水，低熔点琼脂糖，2×完全培养基 2、实验步骤： （1）制备细胞悬液：将对数生长期的单层细胞常规消化离心收集细胞沉淀。重悬细胞沉淀，计数，可倍比稀释至1×103个/mL （2）配置琼脂：用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低熔点琼脂糖溶液，高压灭菌后，维持在40℃防止凝固。按1：1比例使1.2%的琼脂糖和2×完全培养基（含有2×抗生素和20%的胎牛血清）混合后，取1.5ml加入6孔板中（6cm的皿一般注入3mL混合液，直径10cm的皿注入7-10mL），冷却凝固后，可作底层琼脂置于培养箱中备用。 （3）接种细胞：按1：1比例让0.7%的琼脂糖和2×完全培养基在无菌管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，从而形成双琼脂层。最后铺上一层培养基是为了防止胶干燥，并给细胞补充营养，如果做药物处理，则在培养基中加入药物。 （注意！！将琼脂与培液混匀使，要注意琼脂温度，以免烫死细胞，而且动作要迅速，避免局部结块；关于选择接种多少细胞合适的问题，网上给出的细胞数天花乱坠，就个人经验来说，6孔板一个孔200个细胞左右，24孔板一个孔30-50个细胞已足够，太少结果不准确，当然这还要根据细胞增殖能力或者恶性程度来决定，还是那句话，建议摸个梯度） （4）培养：待上层琼脂凝固后，置于培养箱中培养静置2-3周。 （注意：软琼脂克隆的操作相对复杂，很多步骤可能会引起污染，实验过程中一定要注意无菌操作） （5）观察：以肉眼可见的细胞团作为计数集落的标准，计算集落形成率。有条件可用克隆计数仪计数，推荐用ScanProtoCOL克隆计数仪  实验结果图示例：  TIPIN depletion leads to apoptosis in breast cancer cells. Mol Oncol. 2015;9(8):1580-1598.  The T-box transcription factor 3 is a promising biomarker and a key regulator of the oncogenic phenotype of a diverse range of sarcoma subtypes. Oncogenesis. 2016;5(2):e199. 好了，就介绍这么多，希望大家都能做出满意的结果图，别忘了点赞、转发、关注我们，下期见！ 参考文献 [1] Xu M, Chen X, Lin K, et al. The long noncoding RNA SNHG1 regulates colorectal cancer cell growth through interactions with EZH2 and miR-154-5p. Mol Cancer. 2018;17(1):141. [2] Singh M, Bansal S, Kundu S, et al. Synthesis, Structure-Activity Relationship, and Mechanistic Investigation of Lithocholic Acid Amphiphiles for Colon Cancer Therapy. Medchemcomm. 2015;6(1):192-201. [3] Baldeyron C, Brisson A, Tesson B, et al. TIPIN depletion leads to apoptosis in breast cancer cells. Mol Oncol. 2015;9(8):1580-1598. [4] Willmer T, Cooper A, Sims D, Govender D, Prince S. The T-box transcription factor 3 is a promising biomarker and a key regulator of the oncogenic phenotype of a diverse range of sarcoma subtypes. Oncogenesis. 2016;5(2):e199. 文章著作权归文章作者所有 ！ 咨询和合作：cnsmaker@126.com |
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