 活性氧（ROS） 活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）是指生物体内与氧代谢有关的含氧自由基和易形成自由基的过氧化物的总称。常见氧化损伤的活性氧有超氧阴离子，氢过氧基，过氧化氢，羟自由基，R-氧基（烷氧基），R-过氧基（烷过氧基），R-氢过氧化物等。 活性氧是氧正常代谢的天然副产物，主要来源是细胞的线粒体呼吸链，在细胞信号通路、转录等方面发挥重要的调控功能。生理条件下，适量的活性氧可促进免疫、修复、存活、生长等。在氧化应激相关状态下，ROS水平可以大大增加；ROS的积累会严重破坏细胞结构，ROS水平一旦超过内源性抗氧化防御的能力，就会导致DNA、脂质、蛋白质的结构或构像改变，最终导致细胞死亡。氧化应激在心血管疾病，糖尿病，骨质疏松症，中风，炎症性疾病，以及神经退行性疾病和癌症的研究发挥重要的作用。ROS检测将有助于确定氧化应激如何调节各种细胞内途径。
Fig 1 活性氧ROS主要检测方法 活性氧检测方法有化学发光法 、电子自旋共振（ESR）、荧光探针法 、比色法 、高效液相色谱法（HPLC） 、质谱法等。每种方法都有其优缺点和适用范围。在选择合适的检测方法时，需要考虑实验目的、样品类型和研究领域等因素。通过选择合适的检测方法和实验条件，可以获得准确可靠的ROS产生信息，为生物医学研究提供重要的参考依据。 流式细胞仪检测法是使用荧光染料或荧光探针标记细胞，直接观察细胞的荧光信号变化的一种方法，该方法检测的优势有：以单个细胞为统计基础，获得每个细胞的信息，可以同时评估多个特征，还提供高统计能力。此外还有灵敏度高、快速、重复性好，准确且不会引起任何漂白的特点。常见的流式检测试剂有：DCFH-DA(DCF)、DHE、MitoSOX Green& MitoSOX Red、dihydrorhodamine 123（ DHR-123，罗丹明123）等等。通过比较不同药物或处理对细胞荧光信号的影响，可以研究其与ROS产生的关系。
Fig.2几种ROS探针的激发波长及发射波长 DCFH-DA 利用荧光探针 DCFH-DA 进行活性氧检测是一种基于荧光强度变化，定量检测细胞内活性氧水平的最常用方法，DCFH-DA 本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，被细胞内的酯酶水解生成 DCFH，而 DCFH 不能通透细胞膜，从而使探针易于装载至细胞内，细胞内的活性氧可以氧化无荧光的 DCFH 生成有荧光的DCF，在最大激发波长480nm，最大发射波长 525nm处，使用荧光显微镜，流式细胞仪或激光共聚焦显微镜等检测荧光信号。
Fig.3 人脐静脉内皮细胞ROS检测（正常组VS药物处理组） 注意事项： Ø 为保证结果准确且避免试剂损失，测定前请仔细阅读说明书（以实际说明书内容为准），确认试剂储存和准备是否充分，操作步骤是否清楚，且务必取2-3个预期差异较大的样本进行预测定； Ø 探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高； Ø 并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照刺激剂。对于不同的细胞，阳性对照的效果可能有较大的差别，如果在刺激后30min内观察不到活性氧的升高，可以适当提高阳性对照刺激剂的浓度；如果活性氧升高得过快，可以适当降低阳性对照刺激剂的浓度； Ø 尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差； Ø 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。 Ø 整个实验应该避光操作，检测时应用不透光的孔板或管； Ø 浓度太高或者时间太长，会导致背景信号高，具体的探针浓度以及孵育时间，建议自行优化。 一般用于哺乳动物细胞的检测，植物或细菌可以在制备原生质体后进行检测使用，该试剂盒不能检测体内的ROS。 Ø 没标记成功的原因可能是： 1. 细胞状态不好，导致染色效率低； 2. 阳性药物诱导时间过短，一般37℃避光孵育30 min-4 h可显著看到活性氧水平提高； 探针反复冻融4次以上，染色效率降低，荧光信号不稳定（时强时弱、易猝灭）。建议探针分装，避光保存在-20°C冰箱中，避免反复冻融。 Dihydroethidium（DHE） Dihydroethidium (二氢乙锭，DHE)是一种超氧化物阴离子荧光探针，DHE可自由透过活细胞膜进入细胞内,并被细胞内的ROS氧化，形成氧化乙啶；氧化乙啶可掺入染色体DNA中，产生明亮的红色荧光（Ex/Em=518/616 nm），使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测荧光，从而测定细胞内活性氧水平。根据活细胞中红色荧光的产生,可以判断细胞ROS含量的多少和变化。当细胞内的超氧化物阴离子水平较高时，产生的溴化乙锭较多，红色荧光就较强，反之则较弱。
Fig.4 BMDC细胞用5 μM DHE孵育30 min后用流式细胞仪检测-图片来源于网络 值得一提的是，基于 MitoSOX 的流式细胞术不能选择性检测超氧化物，也不能测量 ROS 的量（可间接测）。然而，当使用选择性超氧化物清除剂时，该测定可以产生不同实验条件下或不同样品之间线粒体超氧化物产生的相对量的数据。通过检测Mitosox的荧光信号强度，可以间接评估细胞内ROS水平的变化。 在实际应用中，使用Mitosox需要注意以下几个方面： l 首先，由于Mitosox具有较强的亲脂性，它可以进入细胞内的线粒体，因此主要用于评估线粒体内ROS的水平。 l 其次，Mitosox的荧光信号受到许多因素的影响，如荧光素光照明条件、细胞固定和染色的时间等。因此，在实验设计中需要进行严格的对照组和实验组的设置，确保结果的可靠性和可比性。 l 此外，为了更准确地评估ROS水平的变化，可以结合其他ROS探针和细胞生物学方法进行分析。 如果以最佳浓度使用探针，基于 MitoSOX 的流式细胞术可以可靠地检测细胞中线粒体 ROS 形成的相对差异。建议使用 1 μM 而不是 5 μM 的 MitoSOX 作为检测线粒体 ROS 水平的工作浓度，根据实际样本可做调整。 MitoSOX Mitosox是一种常用的细胞荧光探针，是活细胞渗透性染料。可以用于检测细胞内活性氧（ROS）水平的变化。 它的作用原理主要基于其特殊的分子结构和化学性质。Mitosox的分子结构包含一个具有阳离子性的三甲基咪唑（TMZ）基团和一个荧光染料基团（Green或Red）。由于TMZ基团的阳离子性，Mitosox具有较强的亲脂性，可以穿过细胞膜进入细胞内。在正常的细胞内，ROS水平较低，Mitosox的荧光基团处于非激发状态，不发出荧光信号。当细胞发生氧化应激或ROS水平升高时，Mitosox分子会被ROS氧化，导致荧光基团从非激发态转变为激发态，从而发出强烈的荧光信号（亮绿色或红色荧光）。这种荧光信号的强弱与细胞内ROS水平的变化成正相关。
Fig.5 基于二氢乙锭和Mitosox Red氧化的ROS检测方法的化学原理 MitoSOX很容易被超氧化物（是线粒体中含量最高的ROS，可专门靶向活细胞中的线粒体）氧化，但不会被其他活性氧 (ROS) 或活性氮 (RNS)氧化，表现出高度特异性；超氧化物歧化酶和超氧化物清除剂可抑制MitoSOX的氧化。
Fig.6 MitoSOX Green 和 MitoSOX Red 线粒体超氧化物指示剂的选择性 值得一提的是，基于 MitoSOX 的流式细胞术不能选择性检测超氧化物，也不能测量 ROS 的量（可间接测）。然而，当使用选择性超氧化物清除剂时，该测定可以产生不同实验条件下或不同样品之间线粒体超氧化物产生的相对量的数据。通过检测Mitosox的荧光信号强度，可以间接评估细胞内ROS水平的变化。 在实际应用中，使用Mitosox需要注意以下几个方面：
Fig.7各组NK-92MI细胞MitoSOX Red流式细胞术分析--Mdivi-1对NK-92MI细胞内ROS生成的影响 除了用于研究细胞内ROS水平的变化，Mitosox还可以应用于其他领域。例如，在药物研发中，Mitosox 可以用于评估药物对细胞氧化应激的影响；在环境污染监测中，可以利用Mitosox评估污染物对生物体的毒性作用等。  Dihydrorhodamine 123（ DHR-123） 不带电的非荧光染料 DHR123 是罗丹明 123 (R123) 的衍生物。该探针可渗透进入细胞，被动进入线粒体，并被ROS氧化，形成R123。R123 是一种阳离子绿色荧光染料（λex = 505 nm；λem = 529 nm），可以积累并定位到线粒体中。DHR123 主要用于白细胞氧爆发的评估。在检测中性粒细胞呼吸爆发期间产生的氧化剂方面，DHR123 已被证明比DCFH-DA 更敏感。
Fig.8 DCFH-DA & DHR123探针ROS反应示意图
Fig.10不同处理对粒细胞和单核细胞ROS的影响 除以上注意事项以外还应注意： Ø 以上活性氧检测探针只适合活细胞或活体，主要针对活细胞检测。氧的羟基自由基和超氧自由基的半衰期极短，要注意检测时间。 Ø 检测前尽量避免外界对细胞的刺激，如固定、冰冻等对检测结果会有一定影响，需谨慎选择。 Ø 不适合用于血清或组织匀浆液ROS的检测。 Ø 正常细胞中活性氧含量很低，检测效果可能不会很好。 推荐两篇文章有关氧化应激检测的文章： 1.Flow Cytometry of Oxygen and Oxygen-Related Cellular Stress》氧及氧相关细胞应激的流式细胞术 2.Flow cytometry study of polymorphonuclear neutrophil oxidative burst: a comparison of three fluorescent probes》三种荧光探针（DCFH、DHR、HE)对中性粒细胞氧化爆发的流式细胞术研究 参考文献 [1]BarbosaJ,Costa-De-Oliveira S ,Acácio Gonalves.Rodrigues,et al.Optimization of a flow cytometry protocol for detection and viability assessment of Giardia lamblia[J].Travel medicine and infectious disease, 2008, 6(4):234-9.DOI:10.1016/j.tmaid.2008.01.004 [2]Liu Y, She W, Li Y, et al. Aa-Z2 triggers ROS-induced apoptosis of osteosarcoma by targeting PDK-1[J]. Journal of Translational Medicine, 2023, 21(1): 1-16. [3]Kiani-Esfahani A , Tavalaee M , Deemeh M R ,et al.DHR123: an alternative probe for assessment of ROS in human spermatozoa.[J].Systems Biology in Reproductive Medicine, 2012, 58(3):168-174.DOI:10.3109/19396368.2012.681420. [4]Jávega B, Herrera G, Martínez-Romero A, et al. Flow Cytometry of Oxygen and Oxygen-Related Cellular Stress[J]. Oxygen, 2023, 3(2): 222-255.Walrand S, Valeix S, Rodriguez C, et al. Flow cytometry study of polymorphonuclear neutrophil oxidative burst: a comparison of three fluorescent probes[J]. Clinica chimica acta, 2003, 331(1-2): 103-110. 恭贺新禧 龙年大吉 Happy Spring Festival |
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