 近日，上海大学陈雨团队在《Materials Today》上发表了题为“Reactive oxygen/nitrogen species scavenging multi-enzyme mimetic ultrasmall calcium hexacyanoferrate (Ⅲ) nanozyme for hypertension remedy”的研究文章，创造性地将纳米材料应用于降压领域，合成具有类SOD、CAT、GPX和CAT酶活性的超小六氰基铁酸钙纳米颗粒（CaHF NPs），用于清除RONS，通过恢复内源性氧化还原的动态平衡和减少促炎细胞因子的分泌来缓解高血压，扩大了纳米材料在治疗氧化应激相关中枢神经系统疾病方面的生物医学应用。 研究背景 高血压是一种以高发病率和死亡率为特征的主要公共卫生问题，它显著增加了心脏、大脑、肾脏和其他疾病的风险。高血压的发病机制复杂多样，大多数是由延髓头端腹外侧区的活性氧/氮(RONS)（·OH、NO、O2·—、ONOO—和H2O2）引起的炎症和氧化应激。延髓头端腹外侧区(RVLM)是调节交感神经流出的关键整合中心，也是中枢调控心血管活动的重要部位之一。同时，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)和线粒体呼吸链作为RONS的主要来源，可以通过增加交感神经兴奋性和减少NO供应导致高血压发生。一般来说，NO具有神经保护作用，但它会与O2一起产生有毒的ONOO—，在低氧条件下抑制线粒体呼吸和损伤细胞。 以往研究表明，神经炎症的过程伴随着神经源性高血压。小胶质细胞作为脑组织中的同源巨噬细胞，在抵抗病原体入侵、受RONS攻击等不良刺激后转化为活化的促炎状态、释放炎症因子等方面发挥着关键作用。在激活的小胶质细胞的驱动下，NOX的过度表达会产生过量的ROS，导致DNA损伤，影响细胞膜的完整性，并最终导致细胞凋亡。具有抗氧化能力的天然酶，包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和过氧化氢酶(CAT)，组成了一个强大的防御系统，以维持氧化还原平衡。然而，天然酶的稳定性低、易降解、对环境敏感、成本高、在疾病发展过程中难以充分补充，这在很大程度上限制了生物医学的应用。 大量研究证明了金属纳米酶对中枢神经系统疾病的保护作用，基于金属和金属氧化物的纳米颗粒，例如金、银、铜、钼、铂、铈、铁、钒、黑色素以及碳基纳米系统，已被开发用于催化、成像、传感、神经保护、抗炎、抗氧化、抗菌、抗肿瘤和抗衰老等领域，然而到目前为止，人工纳米酶对高血压的治疗还没有被探索和论证。 为了弥补纳米酶在降压领域中的不足，本研究设计合成了具有多酶活性的超微量铁氰化钙纳米酶用于清除RONS，减少炎症，抑制细胞凋亡，减轻氧化应激引起的炎症和神经毒性，为纳米药物有效治疗高血压提供了新策略。 研究思路  研究要点 一、铁酸钾(Ⅲ)(K3[Fe(CN)6])纳米粒子的合成与表征  图a：六氰基铁酸钾(Ⅲ)(K3[Fe(CN)6])、氯化钙(CaCl2)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)被用来合成单分散的CAHF NPs。 图b：透射电子显微镜(TEM)图像显示CAHF NPs分布均匀，结构接近球形。 图c：动态光散射(DLS)法测定了CAHF NPs在水中的尺寸分布。 图d：CAHF NPs在H2O、PBS、DMEM和FBS中的Zeta电位分别为6.7、45.2、15.9和13.3mV。 图e：CAHF NPs在紫外区有很强的吸收。 图f：CAHF NPs和PVP的傅里叶变换红外光谱(FTIR)，表明PVP和Fe[(CN)6]3-成功连接。 图g：X射线光电子能谱分析表明，C 1s、Ca 2p和Fe 2p的特征峰分别为284.9、346.8和708.8 eV。 二、CAHF NPs的类酶活性 CAHF NPs具有四种模拟酶活性，包括SOD、POD、GPx和CAT，计算出CAHF NPs的超氧化物歧化酶比活力为1.25X103 U/mg，比其他金属基纳米酶，如Cu-SAzyme(448.22 U/mg)和Fe3O4纳米酶(5.65 U/mg)分别高出2.7和250倍，表现出较高的抗氧化能力，有效地清除了细胞内的RONS(·OH、NO、O2·—、ONOO—和H2O2)并在细胞保护中发挥关键作用。  图a：CAHF NPs的SOD模拟活性。 图b：CAHF NPs的GPx模拟活性，其中NADPH的吸光度变化具有时间依赖性。 图c：CAHF NPs模拟GPx活性的Michaelis-Menten曲线。 图d：CAHF NPs的POD模拟活性。 图e：不同浓度CAHF NPs处理后TMB的吸收光谱。 图f：CAHF NPs模拟POD活性的Michaelis-Menten曲线。 图g：CAHF NPs的模拟CAT活性，其中O2的产生具有时间依赖性。 图h：CAHF NPs模拟CAT活性的Michaelis-Menten曲线。 图i：不同处理后DPPH的吸收光谱。 三、CAHF NPs对体外氧化应激的细胞保护作用 CAHF NPs能够保护细胞免受ROS诱导的氧化损伤，经H2O2刺激后，BV2和N2a细胞的凋亡率和坏死率分别增加到31.4%和38.7%，然而，在CAHF NPs治疗后，凋亡和坏死细胞数显著减少。同时，CAHF NPs也能减轻细胞内线粒体的氧化损伤。  图a：采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测BV2和N2a细胞的细胞活力，在选定的浓度下，CAHF NPs具有不明显的细胞毒性。 图b：BV2和N2a细胞在过氧化氢处理后细胞活力均下降，且呈浓度依赖性。 图c：与过氧化氢组相比，CAHF NPs处理后细胞存活率提高。 图d：不同处理后Calcein-AM/PI染色的BV2和N2a细胞的激光共聚焦显微镜图像。 图e：用流式细胞仪检测过氧化氢诱导的BV2和N2a细胞的凋亡率和坏死率。 图f：用DCFH-DA染色的BV2或N2a细胞经不同处理后的CLSM图像。过氧化氢处理后细胞内ROS水平显著增加，而CAHF NPs处理后的荧光强度明显降低。 图e：用JC-1染色的BV2和N2a细胞经不同处理后进行流式细胞术分析。 四、CAHF NPs的体外抗炎作用 CAHF NPs能够通过调节炎症细胞因子和清除RONS来保护BV2细胞免受炎症性损伤。  图a：Western blot分析。CAHF NPs治疗后，与LPS组相比，促炎因子IL-1β、TNF-α和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)水平显著降低，而抗炎因子IL-10水平显著升高。 图b：BV2细胞中iNOS、IL-1β、TNF-α和IL-10的相应分析。 图c：BV2细胞IL-1b(绿色)和iNOS(红色)免疫荧光染色。 图de：IL-1b和iNOS在BV2细胞中相对蛋白表达的统计直方图。 图f：BV2细胞内ROS和RNS的CLSM图像。 图gh：BV2细胞ROS和RNS水平的统计直方图。 图i：流式细胞仪分析BV2细胞内ROS的荧光水平。 图j：不同处理后BV2细胞内ROS的平均荧光强度。 图k：培养上清液中BV2细胞分泌的RNS水平。 五、CAHF NPs的体内毒性研究 CAHF NPs具有良好的生物安全性，可用于体内评价和应用。 六、CAHF NPs的体内降压和抗炎作用 建立应激性高血压(SIH)大鼠模型，用股动脉测压法测量大鼠的血压。刺激后大鼠MAP、ABP、SBP、DBP、HR和肾交感神经活动(RSNA)水平显著升高，在CAHF NPs预处理后显著降低，初步证实了CAHF NPs的体内降压作用。 在正常脑组织中，小胶质细胞是高度分枝的，当大脑发生炎症、感染、创伤或其他神经系统疾病时，小胶质细胞迅速激活，并通过扩大细胞体、缩短其突起，最终变成圆形或杆状，Sholl和骨骼分析结果显示，与正常大鼠相比，SIH大鼠脑内小胶质细胞形态发生改变，胞体变大，分支减少。CAHF NPs预处理后，小胶质细胞的形态恢复到维持正常功能。同时，CAHF NPs可降低高血压大鼠的血压，抑制体内促炎细胞因子的分泌。  图a：高血压模型建立过程的示意图。 图b：不同处理后大鼠的ABP、HR、SBP、MAP、DBP图像。 图c：小胶质细胞在不同处理后IBA1(绿色) 的免疫荧光染色以及Sholl和骨架分析。 图de：不同治疗后大鼠IL-1β、TNF-α、COX2、iNOS、CD86、Arg1的Western blot以及相应分析。 图fgh： IL-1b(红色)、iNOS(绿色)、DAPI(蓝色)的免疫荧光染色及相应分析。 七、CAHF NPs体内抗细胞凋亡和清除ROS的作用 CAHF NPs预处理大鼠的TUNEL+神经细胞数明显少于SIH大鼠。同时，CAHF NPs预处理显著减弱了SIH大鼠促凋亡因子caspase-3、caspase-9和Bax的蛋白表达水平，提高了凋亡抑制因子Bcl-2的蛋白表达水平。这些结果表明，CAHF NPs通过参与对凋亡因子的调控保护细胞免受凋亡损伤。 NOx是高血压时ROS过度表达的主要因素，经CAHF NPs处理后，NOX2和NOX4的蛋白表达水平明显下降。此外，CAHF NPs治疗后，SiH大鼠RVLM中的ROS水平明显受到抑制，表明CAHF NPs在治疗SIH中具有良好的抗氧化保护性能。这些结果证实了CAHF NPs在体内对细胞凋亡和氧化应激的保护作用。  图a：大鼠RVLM内TUNEL(绿色)和DAPI(蓝色)的免疫荧光染色。 图b：TUNEL+细胞数统计直方图。 图c：大鼠RVLM内caspase-3(绿色)和DAPI(蓝色) 的免疫荧光染色。 图d：caspase-3荧光强度统计直方图。 图ef：不同处理后大鼠caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2的Western blot以及相应分析。 图gh：不同处理后大鼠NOX2和NOX4的Western blot以及相应分析。 图ij：不同处理组大鼠RVLM中ROS(绿色)和DAPI(蓝色)的免疫荧光染色和对应分析。 图k：不同处理组大鼠RVLM组织中过氧化氢酶的水平。 八、CAHF NPs对自发性高血压大鼠的治疗机制 为了探讨CAHF纳米颗粒的降压机制，对SiH和SiH+CAHF大鼠进行了转录组分析，结果表明CAHF纳米粒的降压机制可能是通过抗氧化、抗炎和抗细胞凋亡途径来实现的。  图a：SIH组和SIH+CAHF NPs组之间的转录图谱的Venn图。两组共表达19,613个基因，而CAHF NPs处理组仅表达735个基因. 图b：CAHF NPs治疗后显著上调和下调的基因的火山图。显示了84个显著差异表达基因(DEG)，其中52个显著上调，32个显著下调。 图c：CAHF NPs处理后Q值显著差异表达基因的热图。 图d：对不同处理(BP、CC和MF代表生物学过程、细胞成分和分子功能)的SIH大鼠差异表达基因进行GO富集化分析。CAHF NPs明显改变了与免疫反应、免疫系统过程和免疫球蛋白介导的免疫反应途径、一氧化氮生物合成过程、一氧化氮合酶2(NOS2)-分化簇74(CD74)复合体、多Th细胞分化(Th1、Th2和Th17)、细胞因子-细胞因子受体相互作用和精氨酸合成相关的信号通路，表明CAHF NPs的降压机制与抗炎和NO合成有关。 图e：前20个显著丰富的KEGG途径。 图f：对不同处理的SIH大鼠的相关基因进行Circos分析。Circos分析表明与氧化、炎症和凋亡相关的代表性基因，包括超氧化物歧化酶1(SOD1)、过氧化还蛋白1(Prdx1)、热休克60 kDa蛋白1(Hspd1)、小鼠胸腺瘤病毒癌基因同源物3(AKT3)、丝裂原活化蛋白激酶10(Mapk10)和Bex2在两组之间存在差异表达。 文章小结 该研究通过六氰基铁酸钾(Ⅲ)(K3[Fe(CN)6])、氯化钙(CaCl2)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)合成具有类SOD、GPX、POD和CAT酶活性的CAHF NPs，首次将纳米材料应用于降压领域，为纳米材料在治疗氧化应激相关中枢神经系统疾病方面的生物医学应用提供新思路。该研究表明，CAHF NPs能够通过恢复内源性氧化还原动态平衡，减少促炎细胞因子和凋亡因子的释放，维持神经元形态，从而逆转体内血压和肾交感神经活动，防止高血压的发展。拓宽了现有治疗高血压药物的范围，有望成为未来临床应用的潜在替代药物，但其潜在的长期疗效有待于在临床应用前进一步探索。 全文链接 https://www./science/article/pii/S1369702123002080 |
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