  免疫组化（IHC）：利用抗原与抗体特异性结合的原理，使用抗体去标记组织细胞内的蛋白质，然后通过化学反应使抗体显色来确定组织细胞内蛋白质的位置和表达量。 具体操作步骤：组织---制备切片---抗原修复、抗体杂交---显色、封片---拍照、图像分析 柠檬酸修复液（10×）：柠檬酸 8g 柠檬酸三钠 60g 去离子水定容至2L PBS（10×）：Nacl 160g Kcl 4g Na2Hpo4 28.4g K2Po4 5.4g 定容至2L 冰箱里拿出需室温放置30分钟至1小时；捞片需架子上室温晾干10分钟后烘箱烘烤2-3小时 二甲苯I 10分钟 二甲苯II 10分钟 二甲苯III 10分钟 无水乙醇I 5分钟 无水乙醇II 5分钟 95%乙醇I 5分钟 95%乙醇II 5分钟 80%乙醇 5分钟 75%乙醇 5分钟 放入烧杯中蒸馏水冲洗2次，各3分钟 PBST溶液冲洗3次，各5分钟 放进修复液一定要温柔放置脱片，EDTA比柠檬酸容易脱片 可使用EDTA（PH：9.0）或柠檬酸修复液（PH：6.0）使用前预热至95-100℃，放入切片加热约15分钟，室温冷却30分钟。（具体修复液类型参考一抗说明书） PBST冲洗3次，每次5分钟。擦干水分。 3%过氧化氢 37度恒温箱内10分钟。 PBST冲洗3次，每次5分钟。擦干水分。 5%BSA封闭，37℃封闭60分钟。去除后不需要清洗。 湿盒4℃冰箱内孵育过夜，第二天早上37℃复温30分钟。PBST清洗3次，每次5分钟。擦干水分。 湿盒内37℃孵育35分钟。PBST清洗3次，每次5分钟。擦干水分。（注意一抗、二抗种属问题） （现配现用镜下观察) 显微镜下观察呈现棕黄色颗粒时终止染色，清水冲洗掉DAB溶液10分钟。 30秒至45秒（依据组织决定时间长短，可长至5-10分钟），自来水冲洗10分钟。分化液分化2-5秒，自来水冲洗10分钟。 10 75%乙醇 5分钟 80%乙醇 5分钟 95%乙醇 5分钟 无水乙醇I 5分钟 无水乙醇II 5分钟 二甲苯I 10分钟 二甲苯II 10分钟 11 中性树胶封片（注意不要干片） 1. 正常结果是：镜下细胞核呈蓝色，阳性结果呈深浅不一的棕色；结果分析可使用阳性着色细胞计数法和评分法。 2. 需设置对照染色，包括阳性组织对照、阴性组织对照、阴性试剂对照及自身对照。 3. 抗原表达必须在特定部位，不在抗原所在部位的阳性着色，不能视为确切的阳性结果，有可能是非特异染色或假阳性。 4. 非特异染色： 1）抗体问题：建议使用高纯度、高效价、具有特异性的单克隆抗体； 2）抗体浓度过高或孵育时间过长：多做预实验摸索理想的浓度；定好时间避免超时孵育； 3）DAB暗色时间过长或变质：出现棕色时间过短可能是抗体浓度过高，时间过长可能是抗体浓度过低； 4）组织变干：需试剂充分覆盖组织，超出边缘2mm，免疫组化笔需距离边缘3-4mm； 5）内源性酶和生物素：如肝脏、脾脏、肾脏等组织；灭活碱性磷酸酶，使用左旋咪唑（24mg/ml）加入底物液中，PH值维持在7.6-8.2；灭活酸性磷酸酶使用50mmol/L酒石酸一种；内源性过氧化物酶使用0.9%的双氧水灭活；内源性生物素使用25ug/ml亲和素溶液15分钟，PBS清洗15分钟。 6）修复液中浸泡时间过长（可放入4度冰箱中过夜）。 7）清洗不充分：单独冲洗，温柔冲洗，时间要足够，PH和离子强度要符合要求。 8）封闭血清问题：不能和一抗来源一致、一般与二抗同一来源；可使用小牛血清、BSA、羊血清等。 5. 注意脱蜡时间，防止出现染色不均匀、阳性时隐时现、真假难辨、背景染色增多等现象。 |
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