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中医药研究现在是蒸蒸日上，除了生信领域的网药，现在各种结合国自然热点的研究也层出不穷。线粒体相关研究一直是最近几年的中标大户，如果能将中医药与这种热门领域相结合，那中标概率将会大大提升。 今天小薇就跟大家分享一篇这样巧妙结合的高分文章： 1.本研究首次揭示了小分子灯盏乙素（SG）通过调控PDK-PDC轴调节线粒体葡萄糖氧化对线粒体保护和抗细胞凋亡的作用机制。 2.本研究首先基于组织病理、线粒体形态及关键参数、活细胞能量代谢分析等发现对线粒体有氧糖代谢调控作用的活性物质灯盏乙素（SG），同时通过亚细胞水平线粒体蛋白组学和13C同位素标记代谢流研究，发现SG调控的代谢物通路和关键代谢物流量及其调控的代谢酶。 3.基于激酶活性分析、质谱分析和分子生物学实验确证蛋白-小分子结合作用。发现了SG发挥神经保护的作用机制及靶点，即SG通过抑制PDK2增强PDK-PDC轴功能，促进了线粒体有氧糖代谢和线粒体膜电位，并进一步调节线粒体依赖性细胞凋亡发挥神经保护作用。 4.本研究为基于线粒体PDK2靶点的神经保护作用药物开发提供了新策略，同时表明了改善线粒体生物能缺陷的活性成分对神经系统疾病的治疗具有重要价值。 PS：想借助中医药发展的东风开展课题的小伙伴，不妨学习一下这篇文章的设计思路，另外，小薇这里还有各种热点方向的创新思路，课题设计或者申报上有困难可以随时扫码联系小薇哦。
题目：灯盏乙素通过调控Pdk-Pdc轴及线粒体有氧糖代谢挽救线粒体损伤 杂志：ADVANCED SCIENCE 影响因子：IF=15.1 发表时间：2023年11月 公众号后台回复“123”，即可领取原文，文献编号-240313 研究背景 近年来，神经疾病中的线粒体异常已被广泛研究，线粒体功能障碍已被认为是衰老、阿尔茨海默病（AD）和血管性痴呆（VaD）的最终常见致病机制。鉴于神经元组织的再生能力有限，限制神经元损伤和死亡是很重要的。由于葡萄糖可利用性和线粒体功能的缺陷是许多神经退行性疾病的特征，因此可以假设大脑的高能量需求使其对能量燃料供应和线粒体功能变化敏感。根据代谢变化来解释神经元损伤，并寻找可以补救线粒体能量供应的疗法具有重要意义。 灯盏乙素（SG）是来源于灯盏细辛中的一种黄酮类化合物，SG 已被证明具有广泛的心脑血管及神经变性保护药理活性。而线粒体是细胞的能量工厂，线粒体生物能缺陷及其导致的葡萄糖基础代谢降低是促进神经退行性病变等神经系统疾病的关键病理生理调节因子之一。神经细胞和脑组织的功能高度依赖线粒体功能，神经递质代谢与神经细胞的能量代谢密切相关，从能量代谢角度研究 SG 对线粒体及神经系统的保护作用具有重要意义。 研究思路 研究团队建立了靶向线粒体代谢及功能的活性成分发现和药效评价方法：首先基于活细胞能量代谢分析发现对线粒体有氧糖代谢有调控作用的活性物质同时开展亚细胞水平线粒体蛋白组学、代谢组学和 13C 同位素标记代谢流示踪研究，明确活性物质调控的代谢物流向和通量，以及调控的代谢酶。进一步基于激酶活性分析、质谱分析和分子生物学实验确证蛋白-活性成分的结合作用及结合口袋，最终揭示灯盏乙素靶向脑组织线粒体、调控线粒体有氧代谢及挽救受损的线粒体，进而发挥神经细胞保护的作用机制。 研究内容 1.全局蛋白质组分析了CCH的线粒体功能障碍和SG对线粒体有氧代谢的影响。 2.实时细胞生物能量学分析验证了黄芩苷对线粒体有氧呼吸的影响。 3.13C标记的代谢通量分析，结果显示SG可以显著增强[13C3]-丙酮酸盐到[13C2]-乙酰辅酶a的通量，从而增强线粒体葡萄糖源的有氧呼吸。 4.基于活性的激酶评估、分子对接、co-IP、Lip-MS、DARTS、CETSA等，发现SG可以选择性地抑制作为药理学靶标的PDK2的酶活性，从而调节PDK-PDC介导的丙酮酸代谢。 5.通过稳定敲低PDK2的细胞系来验证SG对PDK2的功能作用对线粒体的保护功能。结果表明，SG通过PDK-PDC轴挽救线粒体有氧呼吸，逆转线粒体膜电位损失，减少线粒体损伤诱导的细胞凋亡。 主要结果 1.灯盏乙素改善慢性脑低灌注（CCH）诱导的脑病理生理变化和认知障碍 大鼠颈总动脉（2VO）的永久性双侧闭塞已被确定为研究CCH对认知功能障碍和神经退行性过程影响的一种程序，尼莫地平作为阳性对照。2VO模型已经产生了大量数据，揭示了大脑低灌注和代谢变化、学习和记忆障碍、神经元信号传导失败以及海马神经病理变化的2VO相关模式。应用水迷宫实验、氧化应激试验和组织病理学分析来评估2VO模型的稳定性和SG的治疗潜力（图1A）。神经行为评分采用改良Garcia JH法。水迷宫实验的评估指标，包括逃生潜伏期、效果停留时间和目标交叉点，以及神经行为评分显示，假手术组和SG组均显著优于模型组，表明SG可减少缺血性脑组织的认知障碍（图1B-E）。血凝素-伊红染色（HE）显示，模型组的海马CA1和纹状体区域表现出典型的神经病理学变化，出现显著的细胞充血、收缩和染色丢失（图1I中用箭头标记）。相比之下，SG组的这些特性显著改善。生化参数分析结果如图1F–H所示。 与假手术组相比，模型组SOD和GSH-px显著降低，SG治疗后显著升高。MDA则呈现相反的趋势。这些生化指标的结果表明，SG对2VO模型大鼠的氧化应激损伤具有调节作用。这些结果基本说明SG对CCH的药效作用。
图1 SG可减轻慢性脑缺血引起的病理变化，改善认知障碍，减轻氧化应激 2.灯盏乙素挽救CCH诱导的线粒体功能障碍 线粒体ROS水平是氧化应激的关键因素，如图2A所示。结果表明，与假手术大鼠相比，模型大鼠表现出显著的增加，而与模型组相比，SG治疗显著降低了ROS水平。特别是SG和假手术组的线粒体ROS水平没有显著差异，表明SG可以有效缓解CCH状态下的氧化应激。 采用了一系列的测定方法来用荧光光谱法测量线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放情况，这涉及线粒体状态指标和细胞死亡途径。结果表明，与假手术组相比，模型组通过几乎同时释放线粒体Ca2+（Rhod-2比值信号增加）、线粒体膜电位崩溃（JC-1比值信号减少）和线粒体体积增加（肿胀信号减少），mPTP开放明显，SG治疗能够显著恢复这些变化（图2A）。用分光光度法测定线粒体呼吸链复合物的活性（图2A），与假手术组相比，CCH模型组的复合物活性显著降低，而与模型组相比，SG治疗导致复合物I、III、IV和V的活性相应增加。结果表明，CCH可破坏线粒体复合物，导致能量产生减少，SG可增强几种线粒体呼吸链复合物的活性。 如图2B所示，在假手术组中，所有样本中的线粒体嵴突出，膜完整，而在CCH组中，线粒体肿胀，嵴破裂并向周围移动。SG的管理改善了这些损害。这些结果表明，SG通过调节线粒体稳态和ATP产生，显著减少CCH诱导的线粒体损伤。
图2 灯盏乙素挽救CCH诱导的线粒体功能障碍 3.CCH线粒体功能障碍的全局蛋白质组分析及灯盏乙素对线粒体有氧呼吸的影响 采用了一种发现驱动的无标记定量蛋白质组学方法，并基于2VO模型大鼠脑组织对线粒体蛋白质组进行了分析（图3A）。WB实验表明，分离的线粒体纯度高，细胞质干扰小，适合于线粒体蛋白质组的表征（图3C）。维恩图（图3B）说明了通过这些数据库进行线粒体蛋白鉴定的标准。基于频率分布，作者在模型组与假手术组和SG组与模型组之间鉴定了583和136种差异表达的线粒体蛋白（DEMP，p值<0.05），其中FC>1.3的DEMP分别为525和79（图3D，E）
图3 线粒体蛋白质组学揭示了SG对氧化磷酸化和能量代谢途径的调节作用 4.灯盏乙素在线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）损伤过程中调节线粒体有氧代谢和线粒体形态 使用人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞系建立NaN3诱导的线粒体损伤模型，图4A总结了NaN3对SK-N-SH细胞系细胞活力的剂量依赖性影响。作者研究了SG对NaN3诱导的线粒体损伤细胞中细胞活力的影响，结果表明，表明对NaN3诱导的线粒体损伤具有显著的保护作用（图4B）。主成分分析（PCA）显示，对照组、模型组和SG组有很好的区分，SG组的矢量距离比模型组更接近对照组（图4C）。与模型组相比，对照组和SG组有4种代谢产物同时满足上述条件，包括TCA循环中的富马酸、苹果酸和草酰乙酸（OAA），以及糖酵解和TCA循环的关键环节代谢产物丙酮酸（图4D，E）。然后，对代谢物的定量分析结果采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)模型进行拟合，筛选变量重要投影(VIP)值大于1的潜在生物标志物，学生t检验值<0.05 (图4F)。如图4G所示，SG对NaN3诱导的去极化表现出显著的抑制作用，与模型组相比，MitoTracker深红色强度增加证明了这一点。这些发现表明SG可能对NaN3引起的线粒体损伤具有保护作用。
图4 NaN3诱导的细胞损伤后线粒体的代谢组学和形态学显示，SG在线粒体OXPHOS损伤过程中调节丙酮酸代谢相关的糖酵解和TCA循环 5.实时细胞生物能学分析验证灯盏乙素对线粒体有氧呼吸的影响 作者首先检测了以葡萄糖为碳源的对照组、模型组和SG组的ECARs的变化（图5A）。ECARs结果显示，与对照组相比，模型组的基础糖酵解和糖酵解能力均显著降低，一系列浓度（0.01、0.1、1和10μmol L−1）的SG处理组显著增强（图5B）。作者通过监测各组之间的OCRs变化来测量TCA循环流量（图5C）。细胞线粒体有丝分裂应激测试的结果表明，NaN3处理的SK-N-SH细胞维持了降低的基础OCRs，并且分别对寡霉素、FCCP以及鱼藤酮和抗霉素a的混合物的引入反应最低，这表明线粒体生物能量缺陷。根据定量评估，SG（1μmol L−1）预处理分别显著上调基础呼吸、ATP相关呼吸和最大呼吸的OCRs（图5D）。SG（1μmol L−1）能够显著上调线粒体和糖酵解ATP的产生（图5E）。此外，与模型组（0.58至1.01）相比，SG可显著逆转线粒体ATP/糖基ATP比率，表明SG主要通过调节线粒体有氧代谢来增强细胞能量供应（图5F）。作者测量了添加Eto后各组间OCRs的变化，以评估LCFA氧化对线粒体有氧呼吸的影响（图5G）。结果表明，培养基组和抑制剂组的OCRs没有显著变化，表明SG（1μmol L−1）对线粒体有氧呼吸的改善不归因于LCFA氧化（图5H）。
图5 NaN3诱导线粒体OXPHOS损伤和SG处理后完整细胞中实时ECARs和OCRs的评估 6.[13C6]-葡萄糖标记的SK-N-SH细胞能量代谢途径稳态条件的探索 代谢物在不同时间点的同位素分布如图6C所示。糖酵解过程中大多数代谢物在0.5 h时达到标记稳态，而连接糖酵解与TCA循环并与氨基酸代谢和脂质代谢相关的丙酮酸在6 h时达到标记稳态(图6A)。单循环和多循环均可在6小时内达到标记的稳态（图6B）。
图6 [13C6]-葡萄糖标记的能量代谢途径稳态条件的探索 7.13C-MFA揭示SG在线粒体OXPHOS损伤过程中增强丙酮酸对乙酰辅酶A连接的线粒体葡萄糖氧化的作用 为了进一步证明SG的代谢调节机制，作者使用LC-HRMS技术进行了13C-MFA，以研究氨基酸、糖酵解、TCA循环等代谢的变化。13C-MFA实验过程如图7A所示。模型与SG组[13C3]-乳酸丰度比(0.5 h)无显著差异，说明糖酵解增强并未通过乳酸代谢途径增加能量供应，而主要流向丙酮酸代谢(图7D)。监测丙酮酸-丙氨酸代谢途径，各组之间[13C3]-丙氨酸丰度比没有观察到显著差异（图7C）。与模型组相比，SG显著增强了[13C3]-丙酮酸盐代谢到[13C2]-乙酰辅酶A的流量，从而增强了线粒体葡萄糖源有氧呼吸（图7E）。此外，我们通过蛋白质印迹研究了丙酮酸脱氢酶E2（Dlat）和ATP合酶亚基O（ATP5o）的关键蛋白表达，其分别催化丙酮酸转化为乙酰辅酶A，然后转化为TCA循环，并由呼吸链的ETC产生的ADP产生ATP。与对照组相比，这些蛋白在模型组中均下调，并且在SG治疗组中可显著逆转（图7F）。作者认为SG可以在OXPHOS受损的条件下调节PDK-PDC轴连接的葡萄糖-丙酮酸TCA循环轴，并在氧化磷酸化过程中增加电子呼吸链的有氧代谢（图7B）。
图7 13C-MFA和蛋白质印迹显示SG可以调节丙酮酸代谢相关的葡萄糖-丙酮酸TCA循环轴 8.SG选择性抑制PDK2作为T靶点促进线粒体有氧呼吸和线粒体膜电位 为了验证SG对PDK-PDC轴调节的丙酮酸代谢的影响，以增强线粒体有氧代谢，我们通过测量激酶反应中的非磷酸化和磷酸化底物来进行激酶活性评估。用二氯乙酸（DCA）作为阳性对照，测试SG对PDK2和PDK4的抑制百分比。结果表明，在多种浓度下，SG对PDK2的抑制活性明显高于DCA（图8D）。然后，对接分析表明，SG可以在PDK2的ATP结合结构域、硫酰胺结合结构域和CoA结合结构域周围空间结合（图8A–C）。如图8G所示，当蛋白酶与蛋白质的比例为1:3000时，仍有一定量的蛋白质残留，与对照组有显著差异，因此选择该比例进行后续实验。CETSA实验证实了SG和PDK2蛋白在分子水平上的相互作用，即SK-N-SH细胞中的PDK2蛋白随着温度的升高而降解，但SG的加入减少了PDK2蛋白的降解（图8H）。作者发现SG可以对以PDK2为靶标的NaN3诱导的线粒体膜电位损伤发挥保护作用。硫酰胺结合结构域可能是SG与PDK2结合的主要结合区（图8J）。此外，细胞线粒体应激测试表明，shPDK2 SK-N-SH细胞比载体SK-N-SH细胞保持更高的线粒体有氧呼吸指数，并且SG仅在高浓度（10μmol L−1）下才能上调ATP相关呼吸和最大呼吸的OCRs（图8K–M）。
图8 SG以抑制PDK2为靶点，促进线粒体有氧呼吸，调节线粒体依赖性细胞凋亡 文章小结 探索了新的治疗方法：靶向代谢灵活性的PDK-PDC轴，用于治疗脑灌注不足引起的神经损伤和认知障碍，并发现SG通过选择性靶向PDK2发挥线粒体保护和抗凋亡活性。
图9SG调节PDK-PDC轴和线粒体葡萄糖氧化 本研究采用多组学、代谢流结合细胞能量代谢分析，同时与多种分子生物学实验交叉验证揭示了灯盏乙素通过调控 Pdk-Pdc 轴及线粒体有氧糖代谢挽救线粒体损伤的机制，为基于线粒体 PDK2 靶标的神经保护作用药物开发提供了新策略。 对这个新方法感兴趣的小伙伴，有任何问题都可以直接联系小薇哦，小薇定知无不言言无不尽！ |
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