七氟醚调节VEGF/VEGFR2信号通路对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡和血管生成的影响

《中国计划生育学杂志》2023年第8期

李正凯      冯  玉      冯  锋     王  崇      薛金磊

郑州大学附属郑州中心医院（450007

              

      子宫内膜癌是一种女性常见的恶性肿瘤，发病率逐年升高［1］。癌细胞自身可以生成血管为肿瘤细胞提供营养物质。因此，阻止血管生成在一定程度上可以抑制肿瘤细胞的生长，成为治疗肿瘤的研究方向［2］。七氟醚是一种常用麻醉药，有研究表明其对多种肿瘤细胞增殖、迁移具有抑制作用［3］。孙飞等［4］研究表明，七氟醚通过阻断ERK/MMP信号通路抑制直肠癌HCT116细胞侵袭和迁移；郑孝振等［5］研究表明，七氟醚通过阻断Wnt/β-catenin信号通路，进而抑制结直肠癌SW480细胞增殖，并促进其凋亡。血管内皮生长因子(VEGF)是促血管内皮细胞生长的蛋白质分子，血管内皮生长因子受体(VEGFR2)可与VEGF特异性结合，VEGF/VEGFR2信号通路在肿瘤血管形成过程中发挥重要作用［6］。韩江云等［7］研究表明通过阻断VEGF/VEGFR2信号通路进而抑制人神经胶质瘤U87细胞血管生成；夏雨等［8］研究表明中药复方肠复康胶囊可以抑制VEGF/VEGFR2信号通路进而阻止结肠癌血管生成。因此，本研究就七氟醚调节VEGF/VEGFR2信号通路对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡和血管生成的影响进行探究，以期为临床研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

      子宫内膜癌细胞HEC-1A细胞购自于深圳市豪地华拓生物科技有限公司。

1.2 主要试剂

      七氟醚购自南京北鱼生物科技有限公司；RPMI 1640培养基购自上海信裕生物科技有限公司；胎牛血清购自上海睿安生物科技有限公司；Trizol试剂购自上海圻明生物科技有限公司；反转录试剂盒购自上海烜雅生物科技有限公司；总RNA提取试剂盒购自上海博湖生物科技有限公司；胰蛋白酶购自杭州沃森生物技术有限公司；Transwell小室购自上海代轩生物科技有限公司；MTT试剂盒购自上海伟进生物技术有限公司；si-NC、si-VEGF、pc-NC和pc-VEGF购自上海吉凯基因医学科技有限公司；VEGF-A、血管内皮钙黏着蛋白（VE-cadherin）、核蛋白（Ki-67）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、VEGF、VEGFR2一抗及二抗均购自美国Abcam公司。

1.3 细胞培养

      于RPMI 1640培养基、37℃、5% CO2的环境中培养HEC1A细胞，待细胞生长到对数期时收集细胞传代，行后续试验。

1.4 细胞转染与分组

      取对数生长期的HEC-1A细胞分为对照组（无处理）、七氟醚组（4%）［9］、si-NC（转染si-NC）、si-VEGF组（转染si-VEGF）、七氟醚（4%）+pc-NC（转染pc-NC）、七氟醚（4%）+pc-VEGF（转染pc-VEGF），RPMI 1640培养基重悬细胞后，各组细胞进行相应培养，培养48h进行后续实验。

1.5 细胞增殖

     MTT法、Edu染色检测。将各分组HEC-1A细胞于96孔板中培养，在24h、48h时，分别向每孔中加入10 μl MTT溶液，孵育4h，再加入150 μl DMSO，震荡溶解，酶标仪490nm处检测吸光值。于24孔板中培养上述各分组HEC-1A细胞36h，每孔加入Edu孵育2h，按照试剂盒说明书进行Edu及DAPI染色，荧光显微镜采集各组细胞图像，Image J软件分析、定量各组Edu阳性细胞数及总细胞数，计算细胞增殖率=Edu阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.6 细胞迁移和侵袭

      Transwell实验检测细胞迁移：于Transwell小室的上室中加入200μl HEC-1A细胞悬液（1×105个/ml），在下室加入600μl含血清的RPMI 1640培养基，培养24h后，取出小室，以PBS清洗，以多聚甲醛固定10min，0.1%结晶紫染液染色10min，显微镜下选取5个视野观察迁移细胞数。Transwell实验检测细胞侵袭：用Matrigel胶包被上室，其余步骤按细胞迁移实验操作。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡

     收集各组培养的HEC-1A细胞，用磷酸缓冲液清洗，离心收集细胞，将细胞重悬于500μl结合缓冲液中，根据凋亡试剂盒说明书步骤，加入Annexin V-FITC溶液与PI试剂，室温避光反应15min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.8 体外血管生成实验

     实验前解冻高浓度Matrigel基质胶，用RPMI 1640培养基稀释基质胶，将稀释的基质胶加入96孔板中，每孔200μl，4℃静置20min，转移到37℃、5%CO2培养箱孵育1h，待基质胶凝固后，取各分组细胞胰酶消化处理，将1×104个/l细胞接种于96孔板Matrigel基质胶表面，37℃、5%CO2培养，24h后在倒置显微镜下任选5个视野拍照，观察结果。

1.9 qRT-PCR检测VEGF mRNA和VEGFR2 mRNA水平

      用Trizol试剂提取各组HEC-1A细胞中的总RNA，利用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，用荧光定量PCR扩增cDNA。以β-actin为内参，使用2-ΔΔCt方法分析VEGF mRNA和VEGFR2 mRNA表达水平。引物见表1。

1.10 western blot检测蛋白表达

       用蛋白裂解液裂解各组HEC-1A细胞，蛋白提取试剂盒对细胞总蛋白质进行提取，并检测蛋白浓度，对蛋白进行变性后电泳分离蛋白并转膜，封闭液中封闭之后加入VEGF-A、VE-cadherin、Ki-67、Caspase-3、VEGF、VEGFR2（稀释1-1200）一抗4℃摇床过夜，洗膜后再分别加入相应二抗（稀释1-4000）孵育，然后使用ECL发光液显影，用Image-Pro Plus进行定量分析。

1.11 统计学处理

      用Graphpad Prism 8.0数据分析。以（X±s）表示计量资料，多组间比较采用单因素方差分析，组内两两之间比较用SNK-q检验。差异有统计学意义用P＜0.05表示。

2 结果

2.1 各组HEC-1A细胞增殖能力比较

      与对照组相比，七氟醚组、si-VEGF组和七氟醚+pc-NC组HEC-1A细胞OD490（24h、48h）值和细胞殖率均降低（P＜0.05），而七氟醚组与si-VEGF组无差异（P＞0.05），七氟醚+pc-VEGF组高于七氟醚+pc-NC组（P＜0.05）。见图1（2008页）、表2。

2.2 各组HEC-1A细胞迁移和侵袭能力比较

     HEC-1A细胞迁移个数和侵袭个数，与对照组相比七氟醚组、si-VEGF组和七氟醚+pc-NC组均降低（P＜0.05），七氟醚组与si-VEGF组无差异（P＞0.05），七氟醚+pc-VEGF组高于七氟醚+pc-NC组（P＜0.05）。见图2（2008页）、图3（2008页）、表3。

2.3 各组HEC-1A细胞凋亡率比较

     HEC-1A细胞凋亡率，七氟醚组（43.86±3.48）%、si-VEGF组（41.52±3.84）%和七氟醚+pc-NC组（44.78±4.26）%均高于对照组（13.64±1.73）%（P＜0.05），七氟醚组与si-VEGF组无差异（P＞0.05），七氟醚+pc-VEGF组（32.47±2.69）低于七氟醚+pc-NC组（44.78±4.26）%（P＜0.05）。见图4（2008页）。

2.4 各组HEC-1A细胞VM形成比较

      观察图5可知，对照组细胞具有良好的管腔结构，七氟醚组、si-VEGF组和七氟醚+pc-NC组HEC-1A细胞管腔结构明显被破坏。与七氟醚+pc-NC组相比，七氟醚+pc-VEGF组细胞管腔结构破坏程度减轻，管腔数增加。见图5（2008页）。

2.5 各组HEC-1A细胞VEGF mRNA和VEGFR2 mRNA表达比较

      VEGF mRNA和VEGFR2 mRNA表达，七氟醚组、si-VEGF组和七氟醚+pc-NC组均低于对照组（P＜0.05），七氟醚组与si-VEGF组表达无差异（P＞0.05），七氟醚+pc-VEGF组高于七氟醚+pc-NC组（P＜0.05）。见表4。

2.6 各组HEC-1A细胞各指标蛋白表达比较

     与对照组相比，七氟醚组、si-VEGF组和七氟醚+pc-NC组VEGF-A、VE-cadherin、Ki-67、VEGF、VEGFR2表达降低，Caspase-3表达升高（P＜0.05），七氟醚组与si-VEGF组表达无差异（P＞0.05）；与七氟醚+pc-NC组相比，七氟醚+pc-VEGF组HEC-1A细胞VEGF-A、VE-cadherin、Ki-67、VEGF、VEGFR2表达升高，Caspase-3表达降低（均P＜0.05）。见图6（2008页）、表5。

3 讨论

   子宫内膜癌是一种女性生殖道肿瘤疾病，死亡率居生殖系统肿瘤第1位［10］。由于该疾病早期没有明显症状，确诊时已发展为中晚期，是死亡率高的主要原因［11］。目前该疾病治疗效果不尽人意，中晚期患者面临复发和转移［12］。研究发现，肿瘤细胞可以形成血管为自身提供营养物质，因此，如何阻止血管生成成为治疗肿瘤的研究方向［13］。

     七氟醚是氟甲基六氟异丙基烷化合物，一种吸入性麻醉药物，近代研究表明七氟醚可以影响多种肿瘤的生物学过程［14］。黎皆佳等［15］研究表明，七氟醚通过上调miR-143-3p的表达可以抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭并促进凋亡。姚梦夏等［9］研究表明七氟醚通过上调miR-203的表达可以抑制胶质瘤U87细胞侵袭和迁移。本研究用七氟醚干预HEC--1A细胞，与对照组相比，七氟醚组HEC-1A细胞管腔结构明显被破坏，OD490（24h、48h）值和细胞增殖率、细胞迁移个数和侵袭个数、VEGF-A、VE-cadherin、Ki-67均降低，细胞凋亡率和Caspase-3蛋白表达升高。提示七氟醚可以抑制HEC-1A细胞增殖、迁移、侵袭和血管生成，并促进其凋亡。

     VEGF和VEGFR2属血管生成因子，在肿瘤细胞中过表达促进肿瘤血管生成［16］。李彦明等［17］研究表明，柠檬苦素通过抑制VEGF/VEGFR2诱导的MEK1/2、ERK1/2磷酸化，可以抑制肺癌A549细胞增殖、侵袭和血管生成，并促进其凋亡；郭嘉欣等［18］研究表明硫酸右旋糖苷通过降低VEGF、VEGFR2的表达进而抑制胃癌细胞迁移和血管生成；Gao等［19］研究表明利多卡因通过抑制VEGF/VEGFR2信号通路可以抑制黑色素瘤小鼠肿瘤血管生成，阻滞肿瘤生长。本研究结果表明，与对照组相比，七氟醚和si-VEGF干预后，VEGF、VEGFR2基因和蛋白水平均降低，而七氟醚组和si-VEGF组HEC-1A细胞VEGF、VEGFR2基因和蛋白水平相当，提示七氟醚可以抑制VEGF/VEGFR2信号通路。为进一步证实该结论，本研究在七氟醚干预基础上，上调VEGF表达，与七氟醚+pc-NC组相比，七氟醚+pcVEGF组HEC-1A细胞管腔结构破坏程度减轻，管腔数量增加，OD490（24h、48h）值和细胞增殖率、迁移个数和侵袭个数、VEGF mRNA和VEGFR2 mRNA表达、VEGF-A、VE-cadherin、Ki-67、VEGF、VEGFR2蛋白表达均升高，细胞凋亡率降低、Caspase-3表达降低。表明过表达VEGF减弱了七氟醚对HEC-1A细胞的抑制作用。提示七氟醚通过抑制VEGF/VEGFR2信号通路抑制HEC-1A细胞增殖、迁移、侵袭和血管生成，并促进其凋亡。

     综上所述，七氟醚可以抑制子宫内膜癌细胞增殖、迁移、侵袭和血管生成，并促进其凋亡，可能是通过阻断VEGF/VEGFR2信号通路实现的。本研究仅对一种细胞水平进行研究，后续还需进行多种细胞和动物实验进行验证。