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溃疡性结肠炎（UC）是一种胃肠道慢性复发缓解型炎症性疾病，可显著增加患结直肠癌（CRC）的风险。越来越多的证据表明，肠上皮细胞（IEC）的过度死亡与上皮屏障功能受损密切相关，以IEC死亡为目标恢复肠上皮屏障完整性是治疗结肠炎的关键策略。最近研究揭示铁死亡参与肠道疾病，并且铁死亡的阻断可显著缓解结肠炎症状并恢复肠上皮屏障，提示铁死亡可能是治疗结肠炎的可靠靶点。香草酸（VA）是从当归中分离出来的一种重要的活性化合物，具有显著的抗炎和抗氧化特性。然而，VA 在铁死亡中的潜在作用及其对UC的治疗意义尚未阐明。 2024年3月2日，复旦大学药学院沈晓燕团队在Pharmacol Res（IF=9.3）发表了题为“Vanillic acid restores homeostasis of intestinal epithelium in colitis
through inhibiting CA9/STIM1-mediated ferroptosis”的文章，利用DSS诱导的结肠炎模型探讨VA对UC的治疗效果并揭示其潜在机制，鉴定了VA的直接作用靶点CA9，发现VA可以通过CA9/STIM1介导的铁死亡抑制恢复肠上皮稳态，从而缓解结肠炎，为UC提供了一种有前景的治疗候选者。
研究结果 1、香草酸可减轻 DSS 诱导的结肠炎小鼠的组织损伤和炎症反应 研究首先构建DSS诱导急性结肠炎的小鼠模型发现，VA治疗对体重减轻和结肠长度缩短有显著剂量依赖性缓解，组织学分析显示VA有效改善结肠粘膜损伤和炎症浸润，下调促炎细胞因子水平，减轻DSS诱导的细胞凋亡，降低肠上皮通透性。这些研究结果表明，VA有效缓解了DSS诱导的肠上皮细胞（IEC）损伤并恢复了上皮屏障。
图1 香草酸减轻DSS诱导的结肠炎小鼠的IEC损伤和炎症反应 2、香草酸对铁死亡有抑制作用 已有研究揭示铁死亡参与肠道疾病，阻断铁死亡可显著缓解UC症状并促进肠道修复。因此，VA对铁死亡的调控引起了作者的关注。随后作者证明了VA恢复erastin（一种铁死亡诱导剂）引起的细胞活力降低，逆转erastin导致的GSH水平和GPX4水平的下调，用VA处理的细胞表现出显著较低的细胞内脂质过氧化水平，阻断Erastin 诱导的Fe2+的产生，减弱erastin诱导的线粒体膜电位损失，抑制了铁死亡相关标志物ACSL4和ER应激相关蛋白的上调表达。总的来说，这些结果表明 VA 对铁死亡和铁死亡诱导的ER应激具有显著的缓解作用。
图2 香草酸对铁死亡有抑制作用 3、CA9被确定为香草酸的新靶标 接着，作者试图研究VA调节铁死亡的机制，确定其直接治疗靶点。使用SwissTargetPrediction进行基于结构的虚拟筛选预测了VA的潜在直接分子靶标，发现碳酸酐酶IX（CAIX，CA9）和碳酸酐酶VI（CAVI，CA6）这里种结合力排名前二的蛋白质是VA最有可能的直接靶点。来自GEO数据库GSE112366和GSE73661的临床数据显示，结肠炎患者的结肠样本中CA9显著上调，而CA6没有。对GSE112366的GSEA分析显示在CA9表达水平高的受试者中与铁离子反应相关的信号通路显著富集，这些发现提示CA9可能在结肠炎的发病机制和进展中发挥重要作用，VA可能依赖CA9发挥其抗结肠炎铁死亡作用。随后细胞热位移测定（CETSA）和药物亲和力响应靶点稳定性（DARTS）验证了CA9是VA的直接靶点。
图3 CA9被确定为香草酸的新靶标 4、香草酸通过促进CA9和STIM1之间的相互作用减轻铁死亡 接下来作者研究了CA9在VA介导的抑制铁死亡中的作用以及相关的信号通路。作者发现VA对CA9的蛋白水平没有影响，推测VA对铁死亡的影响可能是通过其调节涉及CA9的蛋白-蛋白互作介导，而不是通过CA9的表达来介导的。作者通过虚拟筛选、免疫沉淀实验和免疫荧光测定发现STIM1可以和CA9稳定结合。此外，STIM1和CA9之间的相互作用和共定位被铁死亡诱导剂erastin抑制。CA9和STIM1的过表达模仿了VA介导的对铁死亡和铁死亡诱导的ER应激的抵抗。此外，CA9或STIM1的敲低显著阻碍了VA的有益作用，并导致显著的脂质过氧化、GPX4的减少、ER应激的诱导以及高活性Fe 2+的产生。这些发现表明VA通过恢复CA9和STIM1的关联来减轻铁死亡。
图4 香草酸通过促进CA9和STIM1之间的相互作用减轻铁死亡 5、香草酸通过调节SREBP-SCD1轴介导的脂肪生成来减轻铁死亡 接下来，作者研究了与CA9相关的信号通路。GSEA和GO分析显示，来自数据库GSE112366的CA9高表达受试者中脂肪酸相关的脂质信号通路显著富集。作者发现VA可以显著着恢复结肠炎小鼠结肠中与脂肪酸和胆固醇代谢相关的基因，表明VA可能通过调节脂质代谢发挥治疗作用。SREBP1 是调节脂质代谢不可或缺的转录因子，控制硬脂酰辅酶A去饱和酶-1 (SCD1) 的转录，将饱和脂肪酸 (SFA) 转化为单不饱和脂肪酸 (MUFA)。先前的研究已经证明了MUFA在抵抗铁死亡方面的关键作用。作者发现VA增强了SREBP1的核定位，诱导SREBP1成熟和SCD1上调。SREBP1的mRNA水平不受VA影响，表明VA可能通过转录后方式调节SREBP1的成熟，从而促进SCD1转录。Fatostatin是SREBP1的激活抑制剂，在erastin处理的细胞中可有效消除VA诱导的细胞活力恢复和脂质过氧化减少。此外，VA的抗铁死亡活性被SCD1敲低和添加SCD1抑制剂CAY10566阻断。这些发现表明SREBP1-SCD1信号通路在介导VA的抗铁死亡中的关键作用。
图5 香草酸通过调节SREBP-SCD1轴介导的脂肪生成来减轻铁死亡 6、香草酸通过CA9-STIM1复合物介导的SREBP1-SCAP复合物与INSIG2的解离促进 SREBP1激活从而抑制铁死 随后作者进一步阐明CA9-STIM1复合物在SREBP1-SCD1信号通路中的作用，发现SREBP1的核定位在CA9或STIM1沉默后被阻断证实CA9/STIM1复合物参与SREBP1的成熟。在静止状态下，SREBP1-SCAP 复合物通过与 INSIG 相互作用牢固地锚定在 ER 膜上，从而防止SREBP1-SCAP易位至高尔基体裂解成核定位的成熟形式，而STIM1和INSIG2形成了稳定结合，STIM1可以通过INSIG2与SCAP/SREBP1复合物结合，并且VA增强了INSIG2和STIM1之间的相互作用，同时削弱了STIM1和SCAP/SREBP1之间的结合。表明VA通过STIM1将INSIG2束缚到ER并削弱了INSIG2与ER的结合。此外，敲低CA9消除了VA诱导的STIM1-INSIG2复合物形成的增强，同时促进INSIG2/SCAP/SREBP1复合物的组装。上述结果表明VA促进CA9和STIM1之间的相互作用，从而促进STIM1和INSIG2之间的结合，导致SREBP1-SCAP复合物从INSIG2解离。该过程促进 SREBP1 易位至高尔基体，裂解成其活性形式，并最终促进 SCD1 的转录活性。
图6 香草酸通过CA9-STIM1复合物介导的SREBP1-SCAP复合物与INSIG2的解离促进 SREBP1激活，从而抑制铁死亡 总结 该研究确定香草酸（VA）是通过与CA9结合抑制铁死亡来治疗UC的潜在候选者。此外，研究结果表明，CA9通过与STIM1相互作用来调节SREBP1的ER-高尔基体转运，这可能为治疗 UC 的新药开发提供新的靶点。 研究要点：（1）VA 通过抑制铁死亡来恢复肠上皮稳态，从而缓解结肠炎。（2）CA9被确定为VA的直接靶点。（3）VA促进CA9与STIM1的结合，从而激活 SCAP/SREBP1 复合物。（4）VA 对铁死亡的抑制依赖于CA9-SREBP1/SCD1轴。 总之，研究表明VA 可以通过CA9/STIM1 介导的铁死亡抑制恢复肠上皮稳态，从而缓解结肠炎。
图7 香草酸缓解结肠炎的作用机制模式图 参考文献 Ni J, Zhang L, Feng G, Bao W, Wang Y, Huang Y, Chen T, Chen J, Cao X, You K, Tan S, Efferth T, Li H, Li B, Shen X, You Y. Vanillic acid restores homeostasis of intestinal epithelium in colitis through inhibiting CA9/STIM1-mediated ferroptosis. Pharmacol Res. 2024 Mar 2;202:107128. doi: 10.1016/j.phrs.2024.107128. Epub ahead of print. PMID: 38438089. |
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