白木香结香机理及人工结香技术|多肉植物|树皮|沉香|白木香|真菌|结香

白木香结香机理及人工结香技术

基金项目：国家自然科学基金（32060357）。

张立宝等

1 白木香概述

白木香（Aquilaria sinensis）属瑞香科沉香属，因其所结香脂丰富，入水即沉而得名，又名土沉香、牙香树、女儿香、崖香、青桂香、莞香、芸香等，当植物的树干受外界不良因素影响后留存的病理组织即为沉香，若所结香脂较少，不可于沉水，则称为黄熟香、栈香；一般为褐色至深黑色，且随颜色加深其品质也随之提高。分布于我国广东、海南、广西、福建、云南、台湾等低海拔山地和丘陵的常绿阔叶混交林中，被《中华人民共和国药典:2020 年版·一部》规定为国产沉香唯一的植物来源，是我国特有的名贵药源植物。白木香所结沉香具有镇静、壮阳、强心、行气止痛、温中止呕、纳气平喘之功效；可调节中枢神经系统、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗抑郁、抗氧化、降血糖、调血脂、解热镇痛等活性；用于治疗胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、咳嗽、风湿、高烧、肾虚气逆喘急等症状，还对糖尿病、阿尔茨海默病等疾病有潜在的治疗作用，因此被历代名医追捧为上品药材，除此之外沉香又多被用于制成香或高级香水、香精、化妆品或具有收藏价值的工艺品等。白木香全身是宝，叶片中主要含黄酮和二苯基酮苷类成分及少量挥发油和萜类化合物，将其制成茶叶冲泡饮用，有助睡眠、养颜美容、消胀气、排宿便、去油脂作用；果实及其提取物在制备抗肿瘤药物中具有重要作用；发达的纤维树皮可作为造纸和人造棉的原材料；同时种子因富含油脂，工业用途也是非常广泛，可用来制香皂、润滑油等。

自然条件下，白木香结香率极低，仅有 7%～10%的树体可以结香，产量较低，高品质沉香资源就变得更为稀少。随着人们对沉香的需求不断增长，产供失衡致使沉香价格一直居高不下，利益趋使下造成了野生沉香资源的掠夺式砍伐，加之生境的破坏，野生沉香树种濒危灭绝，现已被我国列为二级濒危保护植物。

2 白木香结香机理

据史料记载“土人断之，积以岁年朽烂，而心节独在，置水中则沉”是古人对沉香结香的描述。古人早就知道健康的白木香在不受到外界损伤和刺激的情况下不会产生沉香，只有受到风断、雷击、虫蛀、人为损伤及一定刺激后才会产生沉香。人工结香结香研究至今为止已有 100 多年时间，白木香的结香机理仍未明确，目前主要有以下几种假说：

2.1 病理学假说（真菌侵染诱导结香假说）

通常认为沉香结香与其感病有关，微生物的参与是沉香结香的必要条件，结香是因为树体感染真菌而产生沉香。1934 年 BOSE 开始研究沉香的形成，1976 年，BHATTACHARYA 等首次从已结香的沉香树中分离得到 Epicoccum granulatum，从此拉开了沉香内生真菌研究的序幕。我国白木香内生真菌研究可追溯于 1976 年，广东植物研究所通过对白木香结香部位解剖中筛选出一种能够诱导树体结香的真菌——黄绿墨耳菌(Melanotus flavolives)，从而推断出白木香结香与真菌有关。戚树源等与何梦玲等发现并证实了健康白木香木材组织感染黄绿墨耳菌后，可形成白木香倍半萜的主要成分白木香醛与色酮类化合物等成分，并随时间不断增加，进而诱导沉香的生成；SUBEHAN 等通过对印度尼西亚沉香树的实地调查研究发现镰刀菌(Fusarium laseritum)能促进白木香的结香；王东光通过对 20 种真菌结香效果的研究表明，龙眼焦腐病菌(Lasiodiplodia theobromae)、斑点青霉(Penicillumameleagrinum)、黑绿木霉(Trichoderma atroviride)、拟康氏木霉(Trichoderma koningiopsis)、青霉病病原菌(Penicillium italicum)、腐皮镰孢(Fusarium solani)、可可毛色二孢菌(Botryosphaeria rhodina)对沉香物质的形成有促进作用；谭小明等总结了 2018 年以前已报道的诱导沉香形成的内生真菌主要有 20多种，涉及 6 纲 9 目 13 科，其中，以镰刀菌属真菌为主；黄秋伟等从结香部位分离出 11 株内生真菌，经苄基丙酮耐药筛选发现，镰刀菌属 G7 耐药水平较高，将其选作人工结香菌，可促进结香，并且耐卡基丙酮能力可作为筛选人工结香菌的重要指标之一；陈旭玉等研究发现拟层孔菌(Fomitopsissp.)可以促进沉香的形成；谷丽萍等采用可可毛色二孢与腐皮镰孢菌开展了白木香野外接菌结香试验，结果表明结香真菌侵染白木香引起组织局部坏死反应，进而促使胼胝质积累以应答病原真菌引起的植物逆境胁迫，胼胝质参与了植物的生理防御反应以及沉香树脂的形成过程。

2.2 非病理学假说（物理、化学伤害诱导结香假说）

众多学者认为物理化学伤害是沉香形成的主要原因，陈怀琼选用了 10 种有机可代谢的化学试剂溶液进行输液法处理，证实化学试剂输液能够促进树体结香；崔晋龙等在白木香诱导菌中首次筛选出 3 株在短时间内诱导白木香产生高品质的沉香倍半萜类化合物；廖永翠发现外源茉莉酸甲酯（MeJA）能显著诱导白木香树和愈伤组织中沉香半倍萜物质的合成与积累，首次在沉香属植物中，针对沉香倍半路生物合成调控机制上开展的关于 JA 信号分子通路较系统的研究,同时明确了 JA 信号分子与沉香倍半萜的形成具有直接的关系；吕菲菲等对白木香愈伤组织伤害诱导形成倍半萜过程中活性氧的产生和积累研究表明 ROS 各组分作为信号分子均响应于伤害刺激，且各组分响应强度差异可协同调控白木香愈伤组织防御反应促进倍半萜合成；蒋妍风羊利用组织培养技术获得白木香不定根，以此为材料进行茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate）诱导半倍萜类物质及相关基因表达变化的研究推测出茉莉酸甲酯对白木香健康植株结香有一定的刺激诱导作用。张鹏等研究表明在物理伤害诱导下白木香应激增强，茉莉酸、乙烯、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、总酚、总萜以及乙酰辅酶 A 等应激反应的特征物质的差异性，可作为快速判断易结香白木香品系的有效生理指标。

2.3 创伤-病理学假说

国外对白木香的结香机制研究起步较早，他们发现芳香油脂物质主要集中于韧皮部，并存于病树有隔膜真菌的菌丝中，而正常健全的树体，却少见有芳香油脂出现，认为健康的白木香树体不能结香，结香的主要原因是开放性伤口造成一些生理的阻碍（如物理创伤、天然虫漏、真菌侵染等），经其联合形式而形成沉香，并非由于特殊的真菌产生，真菌的侵染只是次要因素。国内研究人员认为白木香是典型的诱导型药用植物，只有在伤害胁迫下才能产生沉香。张征等和吕菲菲等研究发现伤害胁迫可刺激信号分子 H2O2爆发，并积累茉莉酸（JA）、水杨酸（SA）、乙烯（ET）进而诱导白木香产生沉香类物质。刘培卫等通过交替氧化酶基因（AOX）对白木香伤害胁迫响应的研究，证实了伤害胁迫可显著诱导白木香交替氧化酶基因的表达，认为白木香 AsAOX1a 和 AsAOX1d基因是伤害胁迫的高度响应基因其中 AsAOX1a 基因起到了传递伤害信号的作用，同时还发现低浓度H2O2能诱导交替氧化酶基因的表达，而高浓度的 H2O2对交替氧化酶基因的表达有一定的抑制作用。黎建雄等认为沉香经人为或自然创伤后，基于自我保护机制产生了逆境物质，同时伤口被微生物侵染，真菌将逆境物质分解形成代谢产物，随着代谢产物的沉积便形成沉香。这一观点出发，可以认为沉香产香是胁迫反应和微生物代谢的结果，两者缺一不可。

2.4 防御反应诱导结香假说

张争等认为伤害或真菌侵染均是作为激发子诱导白木香产生防御反应，产生具有抑菌活性的防御物质(药材沉香的主要化学成分)，这些防御物质与细胞其他组分复合形成的侵填体堵塞了次生木质部的导管和维管束，以抵御外界物理、化学伤害或真菌侵染对白木香的进一步损伤，进而提出“白木香防御反应诱导结香假说”。

2.5 激发子诱导结香假说

激发子（elicitor）是一类能激活寄主植物产生防卫反应的特殊化合物。按照来源可分为生物源和非生物源激发子；生物源激发子指来自病原物、非病原物、寄主植物和非寄主植物能够诱导植物产生防卫反应的物质，非生物激发子包括一些非生物来源化合物物等，如水杨酸、乙酰水杨酸和茉莉酸甲酯等。1968 年 CRUICKSHANK 等[38]在丛梗孢菌 Monil 的菌丝体中提取到一种多肽(monilicolinA)，能够诱导菜豆内果皮形成和积累异黄酮植保素——菜豆素 fphaseollinJ，这是真菌作为激发子的首次报道；MICHIHO 等将茉莉酸甲酯加入至白木香悬浮细胞中，诱导产生了白木香倍半萜化合物。

QI 等与何梦玲等以白木香根悬浮培养细胞为材料，黄绿墨耳真菌提取物为诱导子，首次在组织培养物中成功诱导了 2-(2-苯乙基)色酮化合物的产生。YU 等研究认为色酮化合物是白木香细胞在逆境状态下重新合成的次生代谢产物，而且白木香细胞的次生代谢物合成机制与白木香整体植株组织薄壁细胞的次生代谢物合成机制是相似的。

3 白木香人工结香

3.1 物理创伤结香

3.1.1 凿洞法

选取干径 10 cm 以上或者树龄较大的树，距地面 50～100 cm 以上开孔，孔径 1～2 cm 为宜，最大不能超过 4 cm，孔距 7 cm，深 3～4 cm，行距 15 cm；封口方式可选择泥巴、白木香屑、保鲜膜、脱脂棉等，封孔后应立即剪掉部分枝条以减少蒸腾作用避免树体大量失水。此方法人工处理 2 年后在封口处即可结香，3～5 年后即可取香，结香速度较快且取香后伤口处仍可结香，但结香时间长，开孔密度不宜过大，必须砍掉部分枝条，以减少蒸腾作用，否则会造树体死亡。除可在树干凿洞外，树体砍掉后留下的树桩还能再保存 6～15 年，通过刺激可以在根部产生结香，并可在根部凿洞取香。此外将人工筛选可诱导结香的真菌、细菌、激素或化学药剂加入孔洞中可加速结香。

3.1.2 砍伤法

香农通常选择干径达 10 cm 左右或 5 年以上白木香大树，距地面 1.5～2.0 m 树干处，横向顺坎数刀，砍出伤面，刀距 30～40 cm，深 3～4 cm。伤口处木质逐渐腐烂脱落分泌褐色树脂即沉香，数年后即可取香，且取香后仍可继续结香。砍伤法所结 10 年以上结香具有天然沉香相似化学成分，可代替天然沉香入药。不足之处在于此方法所结沉香只聚集在断面附近，产量有限。

3.1.3 火烙钉钉法

根据白木香干径大小，一般选择长度合适的铁棍、铁钉或钻头，直接或加热烧红后打入白木香树干深 1～2 cm（也可直接凿穿树干）、行距 1～2 cm、间距 10～15 cm，直接打入的铁钉会氧化与木纤维发生反应数年后便可结香；加热烫伤的洞口会使树体产生胁迫反应诱导树体产生沉香。

3.1.4 火烧树干法

此方法适合树龄 10 年以上干径 20 cm 左右的白木香树，首先根据树龄和干径的大小将白木香树自下而上剥掉 50%～60%的树皮，顶部留叶，然后用棉布将树体包裹后点火，在确保安全作业的前提下可利用喷雾器将一定剂量的汽油喷淋到树干上助燃。燃烧时间可根据干径大小合理选择（一般中等粗细的树体可燃烧 10 min，干径较大的树可以燃烧 0.5 h），直至外表烧焦为止，6～12 个月后即可在创伤面结香。除此之外还可利用喷枪将树体灼烧至烧黑状，数月后树体开裂即可砍树取香，此方法可达到通体结香的效果结香质量更是接近天然沉香，不足之处在于火烧会造成树体死亡，且不可重复取香。

3.1.5 半断干、全断干法或断枝法

将白木香树干或树枝用刀砍伤或直接砍断，使伤口分泌树脂，经过一段时间后即可结香。半断干法是距地面 1～2 m 处，沿同一方向横锯数个伤口，深度为白木香干径的 1/3～1/2，宽 2～3 cm，间距30～50 cm。此方法不会造成树体死亡，并且取香造成的新伤口,经过一段时间后仍可继续结香,取香位置自上而下可直至根部。全断干法则是距离地面 1.0～1.5 m 处将树体直接砍断，并在断面裹上保鲜膜或涂抹泥土或其它物质，从而在受损部位腐烂层以下产生结香层。

3.2 人工接菌诱导结香

3.2.1 真菌诱导

选取树龄 5 年以上或干径较粗的树体，在凿洞法的基础上将特定的真菌（黄绿墨耳菌、镰刀菌、龙眼焦腐病菌、斑点青霉、黑绿木霉、拟康氏木霉、青霉病病原菌、腐皮镰孢、可可毛色二孢菌、拟层孔菌、葡萄座腔菌等）通过伤口注入白木香木质部，接菌后可采用木塞、保鲜膜、泥巴、白木香屑、脱脂棉等方式封口。除此之外张秀环等从白木香健康部位与结香部位共分离出 42 株真菌，其中结香部位分离出 27 株，此部位内生菌多样性较为丰富，青霉属为优势属；黄秋伟等从结香部位筛选出 11 株内生真菌，优势种群为镰刀菌属，内生真菌可缩短白木香结香时间，可作为人工诱导白木香结香技术。结香前后白木香内生真菌差异性较大，不同时期，不同结香部位甚至相同时期内生真菌的种群也不相同，即使是同一种植物，也会因生境、品种和年龄等不同而分离出不同的内生真菌。

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3.2.2 内生细菌诱导结香

BHORE 等[48]从 7 种马来西亚沉香属植物中分离出 18 种不同类型的内生细菌，以短小芽孢杆菌（36.4%）为主，从而研究证实了沉香属植物中有可培养的内生细菌。黄雅丽等研究采用 T-RFLP 培养技术，首次探讨白木香内生细菌的群落结构及结香中的变化，在比较结香和非结香的白木香内生细菌的群落结构及变化后，发现结香后内生细菌的 T-RFs、香农多样性指数有增加的趋势，结香前后白木香内生细菌的种类发生显著、有规律的变化。张苗苗等通过基于 PCR-DGGE 技术分析白木香结香前后内生细菌的变化研究证实了白木香结香前后内生细菌群落存在明显差异，内生细菌可能参与白木香的结香过程。截止目前为止众多学者对白木香内生细菌群落结构等做了相关研究，但内生细菌诱导结香的机制尚未明确。

3.3 通体结香

由于传统结香方式产量低、周期长、品质参差不齐、部分结香方法容易造成树体死亡等缺点，为了解决这一现状，马来西亚、泰国等东南亚国家开始使用输液法结香，国内引进此方法后首先在海南开展结香试验，优化改良后逐渐推广到在云南和广东等地。此方法根据干径的大小可悬挂 1～4 袋药液，首袋药液可用电钻在距地面基部 25 cm 处，以倾角 45°，深度为干径的 1/3 处预先打孔开孔，而后在对侧以相同的方式对称打孔，后续可在 80 cm、130 cm、180 cm 处继续打孔，打孔位置一般不超过 2 m。开孔后将化学试剂、植物激素、真菌等可以诱导或胁迫白木香结香的物质，通过一定的处理方式制作成结香液，立即灌装至特制输液袋内，吊挂在树上，针头插入预先打好的孔中，通过流速控制阀控制结香液缓慢流入孔中，树体通过蒸腾作用将液体经过木质部运输传导至地上各个部分，从而造成整树开放性伤口，数月后即可整树结香，2 年后即可取香。

3.4 化学诱导结香

沉香的化学成分非常丰富，截止 2019 年底，科研人员已分离出 182 种半倍萜化合物和 240 种 2-(2-苯乙基)色酮，其中大部分化合物来源于沉香属植物，从此引发化学法诱导白木香结香的研究浪潮。林奇艺等[51]早在 2000 年时就已证实吲哚丁酸、乙烯利和赤霉素能够诱导檀香结香，这让化学法诱导白木香结香成为可能。印度尼西亚人将一定浓度的甲酸或乙烯利等化学药剂注入树体，刺激树体产生防御反应产生沉香；宋晓琛等通过无机盐与激素混合成功诱导结香，发现了结香的主要诱导因子为 NaCl 和乙烯利，其中乙烯利起主导作用；JIA 等采用 PCR、限制性片段长度多态分析（RFLP）、ITS 文库测序等非独立培养的方法对白木香叶片微生物群落进行了研究，结果显示柱孢霉、葡萄孢霉、球孢霉与沉香的形成有关；甲酸与葡萄孢霉菌作为结香剂通过输液法结香 1～2 年后可获得优质的沉香。国内外众多专家学者经过大量的人工筛选试验证实了乙烯利、茉莉酸甲酯、水杨酸、氯化钠、甲酸、氯化亚铁、三氯化铁和亚硫酸钠等可诱导白木香结香。此方法结香速度快、操作简单，但所产沉香味道刺激性较强，价格低，当前还不被市场认可，而且使用的化学药剂是否会对环境造成污、所产沉香能否达到国家药典要求、使用后对人体有无毒害等因素当前还尚不明确，因此应谨慎选择诱导物，将环保、绿色、无公害作为今后化学法结香的研究方向。

3.5 虫漏结香

自然状态下昆虫侵蚀白木香树体，树体分泌油脂物质经过一段时间后形成的沉香称之为虫漏结香。虫漏沉香外表具有明显的油脂线，分布不均且数量随着年份的增长而增加；其毛孔较为独特，分裂不均匀。因其味道香甜醇厚，无公害，无环境污染，且结香质量高于机械损伤，市场价值高，所以虫漏沉香在市场上颇受欢迎。顾小辉等首次报道了虫漏沉香可由天牛、木蠹蛾、白蚁等昆虫伤害形成。本课题组设想利用蛀干昆虫（小蠹虫、天牛幼虫）携带可诱导白木香结香的内生真菌侵蚀白木香树干，从而使白木香受到昆虫物理伤害产生胁迫反应的同时，昆虫携带的真菌也能侵染树体，诱导白木香产生沉香。此方法在促进白木香结香提高经济价值的同时还可解决森林蛀干虫害达到生物防治目的从而获得一举两的效果。

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4 研究展望

目前对于白木香人工结香促进技术的研究主要集中在利用物理、化学、生物或其组合等形式来缩短结香时间、扩大结香部位与面积、提高产香质量与效率等方面。除此之外 CHONG 等认为白木香结香的原因与环境因素有关，其发现在雨季同化物和光合产物的主动运输以及水分传导可能比旱季发生的高得多，树体受伤后雨季（ 16～20 个月）变色率是旱季（ 11～15 个月）的 3 倍。同时NOBUCHI 等发现在雨季树体受伤 4 天后木材切片中几乎所有的淀粉粒都从活细胞中消失，而旱季受伤 7 天后仍然存在少量淀粉，此外雨季受伤树体 14 天后的薄壁组织中存在黄褐色液泡，而旱季伤树则需 30 天。当前人们对白木香的结香机理仍不明确，现有人工结香促进技术尚未成熟，虽然在一定程度上缩短了结香时间、优化了操作手段、提高了产香效率，但所产沉香尚未达到野生沉香品质，结香技术仍需改进。本课题组提出的“虫+菌”结香技术可为今后研发、推广具有稳定、高效、环保、可持续的白木香人工结香技术提供经验与借鉴。