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大家好，今天我们来探讨一下如何缩短 WB 实验时间的秘籍。 WB 实验作为生命科学研究中的重要技术，其过程较为复杂，往往需要耗费较长的时间。然而，通过一些技巧和方法，我们可以有效地缩短实验时间，提高工作效率。 看下文献的方法
该文章从制胶，到电泳，转膜等进行了优化，整个实验到一抗孵育可以在80 min内完成。 下面一步步看一下： 1 简化了凝胶制备步骤，从而将整个过程缩短到10 min。 TEMED催化AP生成自由基，引发双丙烯酰胺和丙烯酰胺之间的交联，形成一个三维网络。因此，自由基的分离使混合溶液能够稳定地保存。我们的结果表明，前五种试剂（凝胶制备所需的试剂为去离子水、30%的Acr-Bis、Tris、10%的SDS、TEMED和10%的AP）可以混合到一个系统中，并在4◦C的黑暗中保存一个月或更长时间。这样，整个复合步骤就被简化为预制胶系统和AP。
结果：用不同方法制备的凝胶之间的信噪比没有显著差异。 2电泳缓冲液进行了优化 传统的电泳液最显著的缺点之一随着电压的升高。会丢失部分蛋白质，特别是小分子蛋白，不能显著缩短电泳时间。为了加快电泳速度，作者对运行缓冲液（Tris 38.1 mM、甘氨酸266.7 mM、HEPES 21.0 mM、SDS 3.5 mM、pH 8.3）的配方进行了修改，具体见括号内。改进后的运行缓冲液在室温下200 V下可以在35 min范围内完成电泳。随后，在不同的电压下测试了改进后的电泳缓冲液（表1）。令人惊讶的是，当电压设置为300 V时，它仍然正常工作。
3 转膜缓冲液用乙醇代替了甲醇，发现转膜效果没有变差。
4 不同分子量的蛋白质具有不同最合适的电转移时间
作者广泛地测试了15-130kDa的蛋白质。根据他们的实验经验，建议设置以下参数：10-25kDa、250V、15 min；25-55kDa、250V、20 min；55-70kDa、250V、25 min；以及70-130kDa、250V、30-35 min。 5 0.22µm的PVDF膜比0.45µm的PVDF膜和0.45µm的NC膜对小分子量蛋白（CyC、CD81）的拦截能力明显强。
6 快封优于脱脂牛奶 无蛋白快速封闭液优于脱脂牛奶封闭液，可防止一抗非特异性结合，提高信噪比。作者比较了聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40）1% + Tween 20 0.05%与5%脱脂牛奶+ Tween 20 0.05%的阻断效率。在PVP-40阻断10 min时，AKT、Rab27a和CD81的信号强度显著高于脱脂牛奶阻断1h，TSG101、KCa3.1和GAPDH的信号强度也不低于后者。此外，与PVP-40相比，商业缓冲区并没有显示出压倒性的优势。然而，PVP-40的水缓冲液容易发生变质，只能在室温下保存一周。添加0.05-1%的无毒的ProClin（Beyotime，上海，中国）可以大大延长保质期。
通过以上秘籍，相信大家可以在保证实验质量的前提下，有效缩短 WB 实验的时间。希望这些方法对大家有所帮助。 |
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