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四神丸源自《证治准绳》, “治脾胃虚弱, 大便不实, 饮食不思, 或泄泻腹痛等证”。是治疗脾肾阳虚泄泻的经典名方, 临床效果肯定。中国药典四神丸（SSW）的处方是：肉豆蔻（煨）200g 补骨脂（盐炒）400g 五味子（醋制）200g 吴茱萸（制）100g 大枣（去核）200g。 四神丸被广泛用于慢性腹泻、非特异性结肠炎和腹泻型肠易激综合征（IBS-D）的治疗。它通过减少炎症和调节肠道微生物活动发挥治疗作用。二神丸由补骨脂和肉豆蔻组成，能缓解腹泻，并在大鼠腹泻模型中调节AQP4和NHE3的表达。然而，SSW对IBS-D患者的影响确切机制尚不明确。 肠易激综合征（IBS）是一种功能性胃肠疾病，其特征是慢性或反复发作的胃肠症状，但没有主要的结构性改变。其主要临床症状包括反复发作的腹痛/腹胀，通常伴随着肠道习惯的改变和排便障碍。对肠易激综合征全球患病率的系统性和荟萃分析表明，按照罗马IV标准，腹泻型肠易激综合征（IBS-D）是最常见的，占IBS患者的40-65%。 IBS-D是一种多方面综合征，由多种因素引起，例如膳食、内脏过敏、胃肠神经递质分泌紊乱、低度肠道炎症、肠道屏障功能受损和肠道菌群失衡。尽管这些因素可以相互作用并共同导致该病，但IBS-D的病理联系仍然未知。因此，目前对于IBS-D的治疗方法缺乏明确定义的治疗靶点。研究表明，肠道屏障功能障碍在IBS-D的发病机制中起着重要作用，肠道通透性与腹泻和腹痛的严重程度呈正相关。由粘液蛋白细胞产生的粘液层充当了第一个屏障，阻止了肠道细菌与结肠上皮细胞的直接接触。研究表明，腹泻破坏了结肠的粘液层并导致粘液合成异常。内质网（ER）是新的跨膜蛋白、分泌蛋白和脂质的生物合成和折叠的关键地点，在肠道组织中广泛存在。ER应激作为细胞内在的开关限制粘液分泌，而自噬通过缓解ER应激维持适当的粘液分泌和肠道稳态。因此，针对肠道上皮细胞内质网的定向调节可能是改善IBS-D肠道屏障的重要途径之一。 近日，天津中医药大学高秀梅教授、王小莹教授、戴永娜博士共同在Phytomedicine杂志上发表题为《Sishen Wan enhances intestinal barrier function via regulating endoplasmic reticulum stress to improve mice with diarrheal irritable bowel syndrome》的文章，揭示四神丸对腹泻型肠易激综合征（IBS-D）相关症状的保护作用。 四神丸对IBS-D小鼠胃肠运动的影响 为了研究四神丸（SSW）对IBS-D小鼠的影响，作者制备了IBS-D模型，SSW给药分成高中低三个组，首先监测了体重的变化。在应激期间模型组体重增长延迟，而SSW-L组显著增加了IBS-D小鼠的体重（图1B）。3周的模型组经历了内脏敏感性的增加。四神丸和洛哌丁胺有效地逆转了基础内脏敏感性反应的影响。 且模型组小鼠粪便软化（图S1），表明出现腹泻。因此，这个模型引起了具有腹泻特征的胃肠生理变化。然而，四神丸中的SSW-M、SSW-H和洛哌丁胺显著改善了粪便布里斯托尔评分和粪便中水分含量，SSW-L、SSW-M、SSW-H和洛哌丁胺对2小时内的粪便颗粒输出产生了显著影响（图1D-F）。
图1. 四神丸对IBS-D小鼠胃肠运动的影响 四神丸改善肠道神经递质代谢紊乱 如图2A所示，模型组小鼠显示出明显升高的5-HT、VIP和SP水平，而SSW组观察到部分逆转。在结肠中，与模型组相比，SSW-M、SSW-H和阳性药组的5-HT水平显著降低。因此，SSW治疗抑制了结肠兴奋性神经递质的分泌，并改善了IBS-D小鼠的肠道运输。 四神丸恢复了IBS-D小鼠的肠道形态和屏障功能 H&E染色显示模型组的结肠腺细胞明显减少，并且有少量淋巴细胞和中性粒细胞浸润(图2D）。值得注意的是，通过四神丸干预治疗，显著改善了45%乳糖饮食和慢性不可预见的压力所引起的结肠病理变化。肠粘膜的组织学和透射电子显微镜结果支持IBS-D患者肠道结构发生变化，包括超微结构和细胞器的改变。对照组的结肠微绒毛完整且排列整齐。而在模型组中，微绒毛有大量破裂，排列分散，细胞间隙增加，间细胞连接减少。在SSW-L组中，一些微绒毛破损，绒毛尖端囊泡化，以及观察到肿胀和破裂的线粒体。与对照组相比，SSW-M和SSW-H表现出完整的微绒毛和减少的细胞间隙。这些结果表明，SSW可以增强肠道上皮细胞之间的紧密连接（图2E）。与对照组相比，模型组的结肠AB-PAS染色显示腺细胞受损更严重，伴随着粘液层变薄，这些变化通过SSW-M和SSW-H治疗得到了显著改善（图2F）。
图2. 四神丸改善肠道神经递质代谢紊乱 四神丸恢复了IBS-D小鼠的肠道形态和屏障功能 如图3A所示，腺体膜表面与上皮表面融合，并通过异位分泌释放粘液颗粒。对照组的腺细胞含有大量胞浆粘液，排泄正常。相反，模型组和SSW-L组的腺细胞中粘液含量较少，排泄显著减少。在SSW-M、SSW-H和阳性药组中，腺细胞的胞浆含有大量粘液，排泄正常。此外，还检查了结肠内主要紧密连接（TJ）蛋白的表达水平。作为肠道粘液屏障和机械屏障完整性的生物标志物，模型组中MUC2和Occludin的产生逐渐减少，与对照组相比，模型组中Claudin-2（一种可能破坏TJ屏障的孔蛋白）升高。此外，与模型组相比，SSW-M、SSW-H和阳性药组中MUC2和Occludin的表达水平较高，并且SSW-H组中Claudin-2的表达水平较低（图3B）。此外，与对照小鼠相比，IBS-D小鼠肠道中MUC2和Occludin的荧光强度显著降低；四神丸和阳性药的治疗显著增加了它们的表达（图3C）。此外，SSW干预还改善了IBS-D小鼠肠道TJ蛋白ZO-1和Claudin-1（图S3）。因此，SSW治疗可以改善IBS-D小鼠的肠道屏障功能。
图3. 四神丸恢复了IBS-D小鼠的肠道形态和屏障功能 SSW治疗激活自噬以减轻IBS-D小鼠的内质网应激 先前的研究表明，激活自噬可以减轻内质网应激，导致粘液分泌增加。与对照组相比，IBS-D小鼠肠道中Beclin1和LC3B-II/LC3B-I的蛋白水平下降，P62显著增加。此外，SSW-H治疗可逆转这些蛋白的表达（图4B）。如图4C所示，对照组的结肠内质网结构正常，可以看到核糖体附着。相反，模型组的内质网结构显示扩张，与对照组相比，囊泡腔直径显著增加。在SSW-M、SSW-H和阳性药组中，观察到具有正常结构的大内质网，并且囊泡腔直径显著减小。此外，免疫印迹数据还显示，与对照组相比，这些组的肠道中GRP78、p-IRE1/IRE1、XBP1和CHOP水平显著升高。SSW和阳性药治疗组显示这些蛋白水平显著下调（图4D）。因此，内质网应激可能作为一种细胞内信号限制粘液分泌，而自噬的激活可能在缓解IBS-D中发挥关键作用，SSW干预可能通过这一途径发挥治疗作用。
图4. 四神丸治疗激活自噬以减轻IBS-D小鼠的内质网应激 四神丸治疗重塑了IBS-D小鼠的肠道菌群 为了确定SSW对IBS-D小鼠肠道菌群结构的影响，进行了基于Bray Curtis的PCoA分析。如图5B所示，与相应的对照组相比，模型组的微生物群落发生了显著变化，而在SSW治疗后，微生物群落明显改变。通过Shannon指数、Simpson指数、Chao指数和Ace指数分析，肠道微生物群的丰富度显示与对照组之间存在显著差异。这些指标在SSW治疗后发生逆转（图5A）。在肠道菌群组成的变化中，对属水平的调查显示，模型组和SSW组中乳酸菌、Muribaculum和Bacteroides减少，而SSW治疗后Blautia、Muribaculum和Ruminococcus torques群明显增加（图5C）。火山图显示在SSW治疗后Erysipelatoclostridium_ramosum、Clostridiales_bacterium_CIEAF_016、Firmicutes_bacterium_M10-2、Lachnoclostridium_sp._YL32和Ruminococcus_gauvreauii显著增加（图5D）。使用LDA分数为4.0来确定具有统计学意义的肠道菌群。同时，LEfSe在线分析显示对照组中Muribaculaceae和乳酸菌丰度较高，模型组中双歧杆菌丰度较高。在SSW治疗后，主导菌株为阿克曼氏菌、Bacteroides和Blautia（图5E）。总之，结果表明SSW治疗在IBS-D小鼠中引起了肠道菌群多样性的显著改变。
图5. 四神丸治疗重塑IBS-D小鼠的肠道菌群 总之，在这项研究中，作者利用不同的药理学方法和IBS-D小鼠模型，调查了四神丸对IBS-D相关症状的保护作用。结果显示，四神丸治疗减缓了小鼠的胃肠运动，通过激活自噬并抑制内质网应激促进了肠道粘液分泌和肠道屏障保护。此外，四神丸改善了小鼠的肠道微生物群落。
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