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题目：The MpNAC72/MpERF105-MpMYB10b module regulates anthocyanin biosynthesis in Malus 'Profusion’ leaves infected with Gymnosporangium yamadae 刊名：The Plant Journal 作者：Yu Wang, Houhua Li et al. 单位：Northwest A&F University, Yangling 日期：27 February 2024    01 摘要 
02 技术路线  Ten 10-year-old M. 'Profusion’ grown in the Northwest A&F University crabapple germplasm nursery in Yangling Construction of vectors and transformation Total anthocyanin content assay Agroinfiltration of Malus fruit and leaves Generation of transgenic M. 'Orin’ calli and M. 'Gala’transgenic lines Measurement of ethylene by ELISA Y1H，Y2H，EMSA，BIFC、Dual-luc 03 主要结果 3.1 G. yamadae侵染促进叶片花青素和乙烯含量的增加 在M.“Profusion”感染G. yamadae后，花青素物质在斑点处迅速积累，在斑点周围产生红色，并且随着锈病的发展，红色区域逐渐增大，最终导致斑点变干并限制锈病的发展（图1a）。紫外分光光度计结果表明，总花青素含量随着锈病的发展逐渐增加，S1期花青素含量较低，为192 mg kg -1，略高于对照，S4期花青素含量最高，是对照的11.32倍（图1b）。随着病害的发展，锈斑处乙烯含量呈线性增加，花青素积累的开始与锈斑处乙烯快速释放的开始一致（图1c）。相关分析表明，苹果锈斑花青素含量与乙烯含量变化呈正相关，Pearson系数为0.88。乙烯含量的增加可能促进花色素苷的积累。外源处理乙烯变化后，与对照相比，乙烯利处理下的叶片略微变红，花青素含量显著增加，锈斑周围出现微红色（图1g，h）。相反，在1-MCP处理下，叶片颜色没有显著变化，花青素含量略低于对照，锈斑呈黄橙色（图1g，h） 3.2 感病叶组织差异表达基因的鉴定 大多数花青素结构基因的表达水平在锈菌发育的S3期达到峰值，与对照相比差异最显著。因此，本研究选取S3期的叶片病斑组织（FHB）和未感染的健康叶片组织（FHCK）进行转录组测序分析，以阐明叶片对苹果锈病反应的调控机制。FHB和FHCK中生物重复的分组以及基于Pearson系数的良好相关性表明，鉴定出一种阳性的花青素生物合成调节因子MpMYB10b（MD09G1278600），该调节因子在对锈病敏感后强烈诱导，符合花青素合成途径中结构基因变化的趋势，证实了对感染的反应中大量的花青素积累。 我们在ERF家族中发现了一个ERF转录因子MD01G1177100，该转录因子在疾病易感性后显著上调（图1d），系统发育分析表明，它与梨中的拟南芥AtERF105和PpERF105最为密切相关，因此命名为MpERF105（图S6a）。MpERF105的相对表达水平与MpMYB10b和花青素结构基因的相对表达水平相似，在锈病S4期显著增加20倍以上（图1e），Pearson相关分析表明，它与花青素合成相关基因的表达水平呈正相关，尤其是MpCHS、MpCHI MpANS和MpMYB10b，Pearson系数分别为0.97、0.95、0.95和0.92。因此，我们推测，MpERF105表达上调可能与苹果锈病叶片中花青素的积累有关。 Pearson相关分析还显示，MpERF105与大多数乙烯合成和信号转导基因的表达呈正相关，尤其是MpACO、MpACS、MpERS1和MpEIN3，Pearson系数分别为0.98、0.86、0.94和0.95。我们推测，MpERF105的表达上调是由于乙烯在苹果锈病病菌中积累所致。此外，在M.“Profusion”中发现了几个上调的差异表达转录因子，包括MpbHLH149（MD04G1192700）、MpTCP7（MD16G1243300）和MpNA C72（MD03G1222700）等。MpNAC72在不同锈病期的相对表达量与MpERF105的表达量相似（图1f），随着花青素的积累，其表达量发生显著变化。
3.3 MpERF105的分离与表征 从'Profusion叶中获得了一个全长的MpERF105 cDNA序列。根据苹果基因组BLAST搜索，M.“Profusion”中MpERF105的直系同源基因位于染色体1上(http://www./projects/apple）。测序结果表明，MPERF105cDNA全长为963bp，生物信息学研究表明其编码320个氨基酸的多肽。正如所料，MpERF105包含一个典型的AP2域。根据利用SWISS-MODEL数据库进行的MpERF105三维结构预测，该蛋白具有一个长的C末端a螺旋和一个三链反平行b-折叠。这些特征类似于先前报道的拟南芥和葡萄中的AP2结构域结构，表明高度进化保守性。 我们选择了一些已报道的参与花青素合成的ERF-TFs进行序列比较。结果表明，MpERF105的序列与梨的PyERF73和马铃薯的IbERF71的序列更为相似。MpERF105被确定为一种转录因子，通过亚细胞定位确定其位于细胞核内。对MpERF105启动子序列的分析显示，它包含几个与激素反应相关的顺式作用元件，其中包含乙烯反应元件（ERE）。我们检测了MpERF105是否被乙烯诱导。在乙烯处理后的6、12和24 h，发现M.'Profusion’叶片中MpERF105的转录持续上调。相反，1-MCP处理后MpERF105的表达略有下调。这些结果表明，乙烯对MpERF105的表达有正调控作用。 3.4 MpERF105是花青素积累的正调节因子 MpERF105在苹果果实上的瞬时过表达导致注射部位的显著红色积累（图2a，c），同时花青素总含量显著增加（4.69倍）（图2b）。随后的定量RT-qPCR结果显示，在注射部位，花青素合成相关基因的转录水平也显著上调。与沉默MpERF105时抑制注射部位周围果皮颜色（图2d，f）相反，未注射的水果和注射空载体的水果的注射部位果皮呈现明显红色（图2d），且花青素含量显著高于沉默MpERF105的苹果果皮（6.25倍）（图2e）。qRTPCR分析显示，沉默MpERF105后，大多数花青素生物合成相关基因的表达显著降低，尤其是MpMYB10b、MpCHS、MpCHI和MpANS。将MpERF105稳定地转化到M.Orin愈伤组织中，将转化子命名为MPERF105OE#1和MPERF105OE#3（图2g，h）。在恒定光照条件下，MpERF105 OE愈伤组织变红，而野生型（WT）愈伤组织的颜色没有显著变化（图2g）。与WT相比，MpERF105的过表达增加了花青素的产量（图2i，j）。此外，MpMYB10b、MpNAC72、MpCHS、MpCHI、MpDFR、MpF30 H、MpANS和MpUFGT的表达上调，其中MpMYB10b的表达上调幅度最大，为15.56至17.43倍。 为了进一步验证MpERF105对花青素生物合成的影响，我们还构建了两个MpERF105稳定的转基因'嘎拉’系OE#1和OE#2，其中MpERF105的相对表达水平分别提高了12.92倍和10.93倍（图2k，l，n）。与WT相比，MpERF105 OE转基因'嘎拉’植物显示出明显的红色（图2k），花青素的显著上调（图2m），以及所有花青素生物合成相关基因的上调表达，其中MpMYB10b上调最多，即16.10-19.76倍（图2o）。这些结果表明，MpERF105对花青素的积累至关重要。
3.5 MpERF105提高苹果'丰花’叶片对锈病的抗性 用G.yamadae接种抗性品系M.Profusion和感病品系M.micromalus，研究了MpERF105在其叶片上的表达。感染锈菌后，MpERF105在两种类型的苹果属中均显著上调，其中M.“profusion”中的上调幅度大于M.micromalus。此外，在两个材料不发病期间，MpERF105的表达也存在显著差异，M.“profusion”中的MpERF105表达比M.micromalus高出三倍。因此，我们推测MpERF105也可能在抗锈性中发挥作用。 由于M.“Profusion”没有稳定的遗传转化系统，我们在M.“Profusion”叶片中瞬时过表达并沉默MpERF105，并将转基因叶片人工接种锈病（图3a）。接种后，标记基因GyWSC、GyRLM1和GyPMA1的相对表达显著上调，这表明人工接种转基因叶片成功。 在9 dpi（伤害后天数）时，我们发现，与对照相比，过表达MpERF105促进了花青素的积累和叶片的红色，并且花青素含量在18 dpi时更高（图3b）；与对照相比，MpERF105沉默的叶片颜色没有显著差异，但其总花青素含量（2.01-2.13倍）明显低于对照（图3b）。在18 dpi时，花青素产生相关基因的表达与MpERF105相匹配（图3c）。在9 dpi时，M.“Profusion”叶片开始出现锈斑，在18 dpi时，锈斑数量和pycnia数量更多（图3a）。锈斑的颜色也有很大差异（图3a），pTRV-MpERF105线显示为黄橙色，更容易受到病原体感染，锈斑数量更多。对照品系和pC2300-MpERF105品系在斑点处呈现红色，其中pC2300-MpERF105品系在斑点处积累的花青素较多，红色区域范围较大，锈斑数量最少，约为对照品系的一半。用乳酚棉蓝染色法鉴别脓孢子；在9 dpi时，在pycnia周围基本上没有观察到pycniospore，在18 dpi时，观察到更多pycniospore，聚集在一起形成pycniospore集合（图3d）。转基因叶片上的腐孢子丘面积存在显著差异；pTRV-MpERF105株系在叶片上有最大的pycniospore丘，其次是两个对照株系，差异不显著，最后是pC2300-MpERF105株系（图3d）。这些结果表明，MpERF105是苹果抗锈病的正调控因子。
3.6 MpERF105直接与MpMYB10b启动子结合 发现MpMYB10b在MpERF105转基因材料中表达差异较大，推测其可能是MpERF105的潜在靶基因。为了验证这一假设，从叶片基因组DNA序列中克隆了MpMYB10b启动子（2000 bp）。当融合的pHIS2载体在酵母单杂交（Y1H）试验中与MpERF105 AD共表达时，用proMpMYB10b转化的酵母能够在供应70 mM （3-AT）的（SD/-His/-Leu/-Trp）平板上生长（图4a）。 另一方面，阴性对照没有促进生长（图4a）。这一发现证明了MpERF105直接结合MpMYB10b启动子的能力。此外，构建了用于双LUC发光分析的报告载体和效应载体（图4b）。当MpMYB10b和MPERF105LUC共表达时，在烟叶中观察到更强的LUC发光信号（图4d），并且LUC/REN活性测定结果与LUC发光信号强度一致（图4c）。 接下来，我们分析了MpMYB10b的启动子，并在1380 bp位置发现了RAA基序（CAACA）（图4e），该基序可能是MpERF105的结合位点。为了测试这种可能性，对MpERF105蛋白进行纯化，并进行电泳迁移率分析（EMSA），其显示His标记的MpERF105蛋白在体外可结合MpMYB10b启动子的RAA基序（图4e）。这些发现表明MpERF105可以结合并激活MpMYB10b启动子。 根据在苹果果实中的瞬时表达，MpMYB10b的瞬时过表达导致注射部位周围的红色着色增强，并伴随花青素含量的显著增加（5.68倍）。当MpMYB10b沉默时，注射部位显示出显著的颜色减少，同时花青素含量显著降低（2.41倍）。当MpMYB10b过表达或沉默时，花青素结构基因的相对表达水平与MpMYB10b相匹配。然而，MpERF105和MpNAC72的相对表达水平基本不变。MYB家族转录因子直接和花青素合成途径的结构基因结合。因此，我们克隆了'丰花’中MpCHS（835 bp）、MpCHI（919 bp）、MpF30 H（1595 bp）、MpDFR（1222 bp）、MpANS（1272 bp）和MpUFGT（1303 bp）的启动子。根据Y1H的发现，MpMYB10b能够直接与MpCHI和MpANS的启动子结合，但不能与其他四个基因的启动子结合。 为了确定MpMYB10b是否能够增加MpCHI和MpANS启动子的活性，进行了双荧光素酶分析。pGreenII 62-SK和proMpCHI-LUC/proMpANSLUC的LUC发光信号较弱，而MpMYB10b和proMpCHI-LUC/proMpANSLUC共转化的叶片的荧光强度显著增加。LUC/REN活性分析进一步证实了这些发现。
图4：MpERF105直接激活MpMYB10b基因。 （a） Y1H分析显示MpERF105与MpMYB10b启动子结合。 （b） 用于双荧光素酶分析的载体示意图。 （c） 相对荧光荧光素酶（LUC）活性标准化为Renilla荧光素酶（REN）活性 （d） 48小时后烟叶的代表性图像。 （e） EMSA表明MpERF105与MpMYB10b启动子中的RAA基序结合。 3.7 MpERF105与MpNAC72相互作用 据报道，ERF-TFs通常与其他家族的蛋白质相互作用，从而发挥其功能。在我们的研究中发现，MpNAC72的表达与MpERF105在苹果锈菌'中的表达趋势高度一致。MpNAC72可能是MpERF105相互作用蛋白的候选蛋白。首先，我们克隆了MpNAC72该基因位于3号染色体上，具有1438 bp的开放阅读框，编码480个氨基酸的蛋白质，具有高度保守的典型NAC结构域。 通过亚细胞定位确定MpNAC72是位于细胞膜和细胞核中的转录因子。对MpNAC72启动子序列的分析表明，它包含几个与应激和激素反应相关的顺式作用元件。MpNAC72可能在'丰花’叶片对胁迫的反应中起重要作用。为了研究MpNAC72是否参与乙烯信号通路，我们用乙烯利处理。与对照组相比，MpNAC72的转录水平在6和12 h上调，在12 h达到峰值，随后在24 h降低。1-MCP处理也轻微下调MpNAC72的表达，类似于MpERF105的变化。这表明MpNAC72可以被乙烯调节。 为了验证MpERF105是否与MpNAC72相互作用，进行了Y2H分析。共表达MpERF105 pGBD和MpNAC72 pGAD的酵母菌株可在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade上正常生长，在X-a-Gal和3-AT存在下呈蓝色，与阳性对照相似（图5a）。阴性对照不能在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade上生长（图5a）。为了证实烟叶中MpERF105和MpNAC72之间的关系，进行了裂解荧光素酶（split LUC）活性试验和双分子荧光互补（BiFC）试验（Walter等人，2004）。在BiFC分析中，只有MpERF105 CE/NE-MpNAC72组合在细胞核中产生荧光信号（图5c）。同样，在LUC试验中，只有当nLUC-MpERF105和cLUC-MpNAC72在烟叶中共表达时，LUC活性才较高（图5b）。这些结果证实了MpERF105和MpNAC72在体外和足底的相互作用。
3.8 MpNAC72是花青素积累和抗锈性的正调控因子 为了研究MpNAC72对花青素积累的影响，我们构建了pC1300-MpNAC72和pTRV2-MpNAC72重组载体，并将其瞬时转化到苹果果皮中（图6a，d）。我们发现过表达MpNAC72可促进花青素积累（图6b）和花青素合成途径相关基因的表达（图6c），而沉默MpNAC72可降低花青素积累（图6e）和花青素合成相关基因的表达（图6f）。MpNAC72在M.'Orin’愈合组织中的稳定过表达（MpNAC72--OE#4）（图6g，h）也表明MpNAC72 OE#4促进花青素积累（5.67倍）（图6i）和花青素合成相关基因的1.20倍至2.69倍上调（图6j）。这些结果表明，MpNAC72是花青素积累的正调节因子。 MpNAC72在M.'Profusion’叶片中过表达并沉默，M.'Profusion’叶片接种了锈病菌（图6k）。GyWSC、GyRLM1和GyPMA1在接种后的表达均上调，表明锈病接种成功。在M.'Profusion’叶片中过表达MpNAC72，除了促进花青素积累（图6k，l）和花青素合成相关基因的上调（图6m）外，还可导致叶片对锈病的敏感性降低（图6k，n，o）。在9 dpi时，pC1300-MpNAC72品系叶片锈斑数与对照无显著差异；在18 dpi时，pC1300-MpNAC72品系叶片锈斑数显著低于对照，且锈斑周围积累了较多的花青素，形成了较大面积的红色斑点（图6k）。相反，在叶片中沉默MpNAC72导致对锈病的敏感性增加，pTRV-MpNAC72株系上的锈斑显著多于对照（图6k）。乳酚棉蓝染色显示，pTRV-MpNAC72株系和对照组的pycnia数量显著高于pC1300-MpNAC72（图6n，o）。在18 dpi时，转基因叶片上的腐孢子丘面积存在显著差异，其中pC1300-MpNAC72系叶片锈斑处的腐孢子丘面积最小，pTRV-MpNAC72系叶片锈斑处的腐孢子丘面积最大（图6n）。根据上述MpNAC72的数据，可以得出结论，MpNAC72与MpERF105类似，是防锈性的正调节器。
图6：MpNAC72在苹果果皮、苹果愈伤组织和'丰富’苹果叶片中的功能特性。 （a，d，g）转基因苹果果皮和愈伤组织的表型。 （b，e，i，l）总花青素含量。 （c，f，j，m）花青素相关基因的相对表达模式。 （h） 半定量RT PCR检测MpNAC72在愈伤组织中的表达水平。 （k） 过表达和沉默的MpNAC72 叶片在接种9和18天后的表型。 （n） 接种后叶片的乳酚棉蓝染色。 （o） 转基因叶片中叶绿体的数量。 3.9 MpERF105和MpNAC72共转化提高了总花青素含量，提高了抗锈性 Y1H分析表明MpNAC72不能直接结合到MpMYB10b的启动子。虽然MpNAC72本身对MpMYB10b没有转录活性，但当MpNAC72和MpERF105构建物与启动子：LUC报告子共转化时，LUC/REN比率显著高于单独表达MpERF105的比率（图7a，b）。MpERF105和MpNAC72在苹果愈伤组织中的共表达表明，与单基因过表达相比，共表达积累了更多的花青素（图7c，d），与花青素合成相关的基因也更显著地上调，其中MpMYB10b、MpANS和MpCHI分别上调25.83-、22.17-、19.55倍（图7e）。将MpERF105和MpNAC72共转化到M.'Profusion’的叶片中，并接种锈病菌（图7f）。当MpERF105和MpNAC72共表达时，叶片颜色变红（图7f），花青素含量（图7h）显著高于对照（pC2300+pC1300），MpMYB10b基因上调至27.43倍（图7i）。叶片中的锈病感染程度也存在显著差异，与对照相比，用MpERF105和MpNAC72共转化的叶片上的锈斑显著减少，并且比单独过表达MpERF105或MpNAC72时的锈斑显著减少（图7f）。乳酚棉蓝染色显示共转化叶片中的脓孢子和脓孢子丘区域较少（图7g，j）。这些结果表明，与MpERF105或MpNAC72单基因过表达相比，MpERF105和MpNAC72共转化时，花青素含量更高，抗锈病能力更强。
图7：与MpERF105和MpNAC72共转化后，花青素积累量增加，抗病性增强。 （a） 烟叶中LUC信号的检测。 （b） 荧光素酶报告基因检测MpERF105和MpNAC72共表达对MpMYB10b启动子活性的影响。 （c） MpERF105和MpNAC72共表达后的愈伤组织表型。 （d，h）总花青素含量。 （e，i）花青素相关基因的相对表达模式。 （f） MpERF105和MpNAC72共表达并接种后的叶片表型。 （g） 接种后叶片的乳酚棉蓝染色。 （j） 转基因叶片中叶绿体的数量。 MpERF105和MpNAC72促进花青素积累以响应乙烯。发现外源施用乙烯利促进锈病敏感叶片花青素积累，而施用1-MCP抑制花青素积累（图1g，h）。我们分析了处理叶片中花青素相关基因的表达，qRT-PCR分析表明，乙烯利处理后，MpERF105、MpNAC72和MpMYB10b均显著上调，其中MpERF105上调14.12倍、MpNAC72上调10.78倍和MpMYB10b上调16.43倍，且1-MCP处理后三者均下调（图8a）。花青素合成相关结构基因的表达模式与三种转录因子的表达趋势一致（图8a）。 此外，在用乙烯利处理的M.Profusion叶中，锈菌的pycnia和pycniospore形成的数量减少，但在1-MCP处理下增加（图8b，c）。综上所述，在受锈病侵染的'丰花’叶片中，MpERF105和MpNAC72通过上调MpMYB10b和花青素结构基因的表达来响应'丰花’叶片中乙烯的变化，从而促进花青素的积累。
图8：外源乙烯处理后叶片花青素相关基因表达及锈病敏感性分析。 （a） 花青素相关基因的相对表达模式。 （b） 转基因叶片中叶绿体的数量。 （c） 锈病菌接种后叶片的乳酚棉蓝染色。 04 结论  作者提出了一个简化的模型来说明MpERF105和MpNAC72如何介导M.“Profusion”对苹果锈病花青素的积累（图9）。 锈病感染可诱导乙烯释放，MpERF105和MpNAC72表达显著上调，以响应乙烯变化。MpERF105直接激活MpMYB10b的表达，并与MpNAC72形成蛋白复合物；二者的共表达使MpMYB10b转录水平进一步提高。 MpMYB10b促进花青素结构基因MpCHI和MpANS的激活，导致锈斑中花青素的积累。 此外，过表达MpERF105和MpNAC72除了促进花青素的高积累外，还提高了叶片对苹果锈病的抗性。 这些结果丰富了我们对苹果叶片花青素合成调控机制的认识，为苹果种质选择提供了理论和实验依据。 05 原文获取 原文链接： https:///10.1111/tpj.16697 PDF获取： https://www./h-nd-325.html |
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