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背景：地理隔离和生态分化是如何共同促进山区植物多样性的，这在很大程度上尚不清楚。本研究选取了分布在中喜马拉雅地区的大钟花(龙胆科)和铁破椤(毛茛科)这两个物种数量较少的属，它们都表现出破碎化的分布格局，分布在广泛的海拔范围内。通过总结它们共同的物种形成和分化过程模式，我们旨在了解环境变化如何通过古同种异域和生态分化加速中喜马拉雅地区的谱系多样化。结果：利用ddRAD-seq、叶绿体基因组序列和特异性分子标记，研究了铁破椤和大钟花的系统发育关系、种群结构和历史生物地理。这两个属都是从中新世晚期开始分化的，低海拔地区的古代异种形成了狭窄范围的种或遗存种群。遗传距离与气候、海拔或地理距离之间的曼特尔测试揭示了铁破椤和茎突大钟花的距离隔离模式。大钟花的两个分支分布在完全不同的海拔高度范围，而加利福尼亚铁破椤则呈现出沿海拔梯度的遗传分化模式。此外，我们对加利福尼亚铁破椤进行了形态学测量，发现不同海拔群的叶片形状不同。结论：中喜马拉雅地区植物类群的区域分隔非常明显，并与多种生物地理界线密切相关。由于重大的地质和气候变化，不同海拔定植时的生态分化往往在植物类群内部同时发生。破碎化和准生态分化在不同程度上促进了物种的形成，两者共同作用是中喜马拉雅地区的普遍现象。关键词：比较系统地理学，铁破椤，大钟花，中喜马拉雅，生态分化，栖息地破碎化由于生态位保守性[1,2]，植物物种通常占据特定的生境类型，并将合适的生态位追踪到新的地理区域(即分散)。因此，生态位保守性通过限制对不同于其祖先生态位[3]的新环境的适应，促进了栖息地的破碎化。然而，植物物种也可以通过适应性变化来殖民新的生态位，从而产生生态分化[4]。山地在地形复杂的地区提供了多样化的生境类型和高度的生境异质性。因此，山区植物物种的分化模式与其祖先分布范围内的栖息地破碎化及其适应新生态位的能力密切相关[5,6]。山区生境的减少或破碎化与自然环境下的地质和气候事件直接相关[7,8]。这些事件可能造成了地理或气候屏障，并可能导致局部灭绝，但遗孤种群可能被隔离在相对稳定的环境中(即难民区)，导致基因流动中断，并产生异域物种形成。生态分化与山区所能提供的环境梯度密切相关，地质和气候变化也能促进生态分化。尽管栖息地破碎化和异区生态分化都被认为是促进物种形成的因素，但理清这些过程在山区的相对影响仍然具有挑战性[9,10]。中喜马拉雅地区是温带生物多样性热点地区，物种特有度高[11-13]。也是北半球温带植物区系的现代分布和多样化中心。中新世以来的构造运动和气候振荡增强了该地区高度的维管植物丰富度和特有性[12,14 - 16]。异域隔离已被证明是促进该地区许多植物类群物种形成或种内分化的重要机制(例如[17 - 19])。在该地区已经提出了几个重要的生物地理系[20-22]。除了高度破碎化的栖息地外，该地区还以高山山谷(海拔2000-6000米)为特征，在很小的地理范围内具有高度异质性的环境。这些环境可促进同一物种不同种群的生态分化和本地适应。然而，很少有研究关注生态转移在该地区物种形成或种内分化中的作用[23,24]。此外，在中喜马拉雅地区不同山脉的同一高程范围内，可能有完全不同的环境。例如，中喜马拉雅地区海拔2000米的地区可能是干热山谷，但也可能是非常潮湿的森林。在这一地区环境的异质化过程中，植物可能需要垂直迁移才能找到合适的栖息地，以避免局部灭绝，从而在稳定(或祖先)环境中的种群与可变环境中的种群之间同时产生异域分化和生态分化。但直到现在，这一假设还没有在该地区得到充分的验证，尽管一些研究已经发现姐妹物种(或谱系)之间同时存在着异域分化和生态分化(例如[25-27])。山区特有属或属内特有枝可能是研究特定物种形成或分化过程的理想系统。对特有物种或属的系统地理学研究可以揭示它们在进化时间尺度上的分布范围和生态位演变，从而帮助我们理解和探索物种与特定地理区域内发生的环境变化之间的关系[28]。本文对主要分布于中喜马拉雅地区的两个属的进化历史进行了种群评价大钟花(Hemsl）H. Smith和铁破椤 Balf.f. & W.W. Sm。这两个属是具有代表性的温带类群，它们喜欢温带森林内或附近湿润的环境。大钟花属于龙胆科，包含3种:M. stylophol -rus、M. lushuiensis和M. venosus[29-31];铁破椤属毛茛科Cimicifugeae，包含2种:B. calthifolia和B. deltophylla。[32-37]。这两个属在其整个生物地理分布范围中表现出相似性(图1a和c)，并且都提供了碎片化的分布格局。这两属分布在森林生态系统相对稳定的地区，如华中地区和四川盆地周围的山区，这些地区有许多残存的属或种。它们也都出现在横断山区，经历了剧烈的构造运动和气候振荡。另一个相似之处是，这两个属都出现在广泛的海拔范围内，生长在(或附近)不同温带森林类型的林下植被中。图1 地理分布和系统发育年表。(a)和(c)分别为铁破椤和大钟花在中国的地理分布。阴影区为分布区域。BEAST制作的铁破椤(b)和大钟花(d)的系统发育年表。铁破椤的数据基于78个叶绿体cds序列，而大钟花的数据基于ITS、atpB-rbcL和trl - trnf序列。红色圆圈表示化石校准，绿色圆圈表示二次校准。蓝点表示支持良好的节点(后验概率> 0.95)，灰蓝点表示中等支持(后验概率≥0.85)，灰点表示弱支持(后验概率< 0.85)大钟花的姐妹种(或分支)对分布在不同的海拔范围内，生长在完全不同的植被类型中，微生境分化显著。stylophorus大钟花通常生长在海拔3600 m以上的高寒地区，可出现在各种高寒栖息地，而lushuiensis和venosus这两个低地物种通常出现在海拔2000 m以下，受人类活动影响较大。相比之下，两种Beesia在海拔范围和微生境上没有明显的差异(都生长在潮湿森林的林下)。然而，加利福尼亚B. calthifolia占据了很大的海拔范围(1700 - 3900 m)，可以生长在不同森林类型的林下。因此，物种间可能存在生态分化。虽然不同的植物类群各有特点，但不同的植物类群可能具有相似的分化模式，因为它们在中国-喜马拉雅地区有着相同的地形和气候历史。本研究利用ddRAD-seq、叶绿体基因组、分子片段和形态学数据，揭示了大钟花和铁破椤的生物地理历史，以确定这两个属在进化历史上的相似性。根据我们之前的研究b[30]，大钟花的生态分化是明显的。为了比较这两个属的生态分化，我们研究了白杨的分化过程是否受到生态位分化的影响。通过本研究，我们希望验证栖息地破碎化和生态适应都广泛影响中国-喜马拉雅地区物种分化或分化过程的假设，并且它们的分化过程与该地区的环境异质性密切相关。铁破椤叶绿体全基因组长度从156,961到158,274不等(详见附加文件2:Table S11)。78个非重复的铁破椤叶绿体编码基因的比对长度为69256 bp。根据质体系统基因组学研究，在中新世晚期至上新世早期，Beesia delo - tophyla从b.c althifolia分化而来[5.46 Ma;95%最高后验密度(HPD): 2.69-7.54 Ma[图1b]。来自四川盆地西部边缘的BC1种群代表了B. calthifolia最早的进化分支(图1b)。B. calthifolia的进一步遗传分化发生在上新世晚期至更新世早期(图1b)。大钟花可能起源于早中新世(茎龄:18.9 Ma, HPD: 10.67 ~ 28.14 Ma)，并在中新世中晚期分化为两个分支(冠龄:6.28 Ma, HPD: 2.60 ~ 12.87 Ma)，出现在不同的海拔高度;图1d)。大钟花stylophorus在2.56 Ma (1.09 ~ 4.77 Ma)进一步分化为两个地理谱系，M. venosus和M. lushuiensis也在同一时间分化(2.77 Ma, HPD: 1.75 ~ 6.17 Ma)。对119株铁破椤(加州Beesia 12个种群82株，del-tophylla 37株)进行筛选，共获得1,279,331,182条clean reads，测序深度为6.02 ~ 15.49 X (Additional file 2: Table S4)。共获得666个snp用于进一步分析Beesia(数据集B119)。对3个大钟花种的所有个体进行筛选后，共产生了881,394,581条clean reads，测序深度为6.73 ~ 22.14 X(附加文件2:Table S3)。在使用Stacks发现SNP后，获得了所有3个emegacodon物种(数据集M155)的278个snp。stylophorus(数据集M131)共获得1777个snp。在STRUCTURE分析结果的基础上，我们将铁破椤种群分为5组(图2a-c和f)。delta-K分布结果显示，基于B119数据集的Beesia最佳K值为2(附加文件1:图S7)。从K = 2到K = 4, 3个三角铁破椤居群一致形成一个类群(BD_EH类群)。1700 m a.s.l的BC1群体在K = 2和3时被鉴定为deltophyla和b.c althifolia的混合祖先，但在K = 4时被鉴定为一个独特的进化群体(BC_QCS群体)(图2a-c)。当K = 3和4时，低海拔(1800-2200 m a.s.l)种群(BC2-BC5)和高海拔(2700-4000 m a.s.l)种群(BC7-BC12)形成两个独立的群体(BC_SC和BC_HM群体)(图2g)。有趣的是，在2660 m a.s.l采集的芦水(种群BC6)样本在K = 4时被鉴定为BC_QCS组和BC_SC组之间的混合祖先(BC_LS组)(图2c和g)。BC1和BC6在铁破椤物种中含有最高比例的私有等位基因(附加文件2:表S5)。此外，根据PCA图的前两个轴，BD_EH和BC_QCS群体与其他群体存在差异，这解释了总变异的26.8%和19.5%(图2d)。第三个主成分(解释了8.9%)显示了BC_SC、BC_LS和BC_HM组的子结构(图2e)。系统发育推断证实了这一结果(附加文件1:图S1)。Beesia居群内遗传多样性分析结果表明，deltophyla的核苷酸多样性和观察杂合度(0.013≦π≦0.026,0.019≦Hobs≦0.023)的变异范围低于B. calthifolia(0.017≦π≦0.051,0.017≦Hobs≦0.062;附加文件2:表S5)。其中，BC_QCS群体(Private = 14.11%)和BC_LS群体(Private = 6.91%)的私有等位基因比例高于其他群体(附加文件2:Table S5)。基于M155数据集的大钟花种群在STRUCTURE中形成两个集群。delta-K分布结果显示，在M155和M131数据集上，大钟花和铁破椤的最佳K值分别为2(附加文件1:图S8)。低海拔(分别为1100 m和1700 m)的大钟花venosus和lushuiensis组成一个类群(图2h和1)，高海拔(3690-4000 m)的stylophorus组成另一个类群(图2h)。基于M131数据集的STRUCTURE结果表明，茎尖支霉可分为2大进化枝(MS_EH和MS_HM)和4个亚进化枝(MS_EH1、MS_EH2、MS_HM1和MS_HM2;图2i和j)，关系进一步经PCA和系统发育推断证实(图2k和附加文件1:图S2)。图2 铁破椤 (a-g)和大钟花(h-m)种群划分。(a-c)基于数据集B119 K = 2-4的铁破椤遗传结构。(d-e)基于数据集B119的PCA。(f)基于K = 4的铁破椤遗传结构地理分布。(f)中的虚线圈包含由STRUCTURE推断的组。图中显示了每个铁破椤组的代表性叶片。(h)数据集M155基于K = 2的大钟花遗传结构。(i)和(j)是数据集M131分别基于K = 2和K = 3的遗传结构。(k)基于数据集M155(外)和M131(内)的PCA。(l) M155数据集基于K = 4的大钟花遗传结构地理分布。图中显示了每一种大钟花的代表性花朵。(1)中的虚线圈包含在K = 4时通过STRUCTURE推断出的茎状芽孢杆菌群。铁破椤 (g)和大钟花(m)遗传结构的高度分布和系统发育关系示意图。(g)中的铁破椤遗传结构从B119数据集中推断。橙色虚线和(g)中的数字表示BC_HM类群(> 2700 m)和BC_SC类群(1800-2200 m)的海拔高度。(m)中大钟花的遗传结构是从M155数据集推断出来的。(m)中的蓝色虚线和数字表示m . stylophorus (bbb3690 m)、m . lushuiensis (1700 m)和m . venosus (1100 m)的海拔高度。底部的系统发育树是图1中BEAST结果的简化版本。估计的发生地理区域由biogeobars估算。节点上(g)和(m)的饼状图分别表示(f)和(l)对应的铁破椤和大钟花出现区域的相对概率。产生两个以上可能区域的重建结果以深灰色显示。EH，东喜马拉雅山;HM，横断山脉;盆地:四川盆地;黑色虚线:四川盆地周围的山脉。大钟花种内遗传多样性分析结果表明，M.stylophorus (π = 0.101)的核苷酸多样性高于 M. lush-uiensis (π = 0.084)和M.venosus (π = 0.051);而在数据集M155上观察到的M. stylophorus的杂合度(Hobs = 0.062)低于其他两个物种(附加文件2:Table S6)。在stylophorus中，所有种群都具有相似的核苷酸多样性和观察到的杂合性(附加文件2:表S7)。venosus、M.;lushuiensis和MS_EH2亚支的比例均大于10%(附加文件2:表S6和表S7)。通过biogeobars进行的生物地理模型选择，采用BEAST树，以日本Anemonopsis为外群，DIVALIKE J为支持度最高的模型，占相对权重的58.17%(附加文件2:Table S16)。通过生物地理重建，推测其共同祖先建立在中国西南低海拔地区喜玛拉雅东部地区(> 75%;图2g)。差异事件可能在每组Beesia随后的多样化和形成中发挥了重要作用(图2)。根据MIGRATE-N分析结果(附加文件2:表S12)，高水平基因流(Nm> 5)仅在BC_LS组和两个广泛分布的组(即BC_HM和BS_SC组)之间存在。在使用BEAST树(不包括外群)对大钟花进行生物地理分析时，DIVALIKE J模型以41.98%的相对权重成为优势模型(见附加文件2:表S17)。数据显示，从东喜马拉雅山到中国中部的变异事件显著影响了大钟花类群的多样性(图2m)。MIGRATE-N分析显示，三个大钟花物种之间没有明显的历史基因流动(附加文件2:表S13)。此外，对于m.s stylophorus，仅在MS_ EH2和其他亚群之间发现了高水平的历史基因流(附加文件2:表S14)。铁破椤种群之间的成对FST值范围为0.13至0.88(附加文件1:图S3)。群体BC1与其他群体的遗传分化程度最高，BC6次之(附加文件1:图S3)。基于数据集B119的Mantel检验结果显示，遗传分化与地理距离(isolation-by-distance, IBD, r = 0.403, p值= 0.004)和海拔距离(isolage -by-elevation, IBE, r = 0.238, p值= 0.037)呈显著相关，与气候距离(isolation-by-climate, IBC, r = 0.108，p值= 0.236，图3a-c，附加文件1:图S5)。部分Mantel测试进一步支持了这一结果(附加文件2:表S8)。在排除deltophyla和高度分化群体BC1后，BC_HM、BC_LS和BC_SC群体内的遗传距离随海拔距离(r = 0.547, p值= 0.001)和气候距离(r = 0.393, p值= 0.006)显著增加(图3d-f，附加文件2:表S10)。然而，气候距离不是一个自变量，而是与海拔距离呈部分矩阵相关(r = 0.213, p值= 0.121，附加文件2:表S8)。树干分枝杆菌种群间的成对FST值在0.11至0.78之间(通过数据集M131)，表明该物种的基因组分化程度很高(附加文件1:图S4)。最高的FST被发现M15和其他种群之间的相关性。所有种群的两两FST与地理距离之间存在显著的相关性(r = 0.86, p值= 3e-05，图3g和附加文件2:表S8)，而海拔(r = 0.082, p值= 0.3，图3h)和气候距离(r = 0.145, p值= 0.1795，图3i)与两两FST不相关。图3基于B119或M131数据集的两两遗传分化(pairwiseFST))与地理(按距离隔离;a, d, g)，海拔(隔离-by-elevation, b, e, h)和气候距离(隔离-by-climate, c, f, i)。右下角的数字是Mantel的r和显著性(p值)。红色字体表示相关性显著强(Mantel’s r < 0.01, p值< 0.01)。生态分化可导致临床变异，而临床变异可导致种群间的遗传分化。为了进一步研究临床变异与遗传分化之间的关系，我们首先对海拔800 ~ 3900 m范围内采集的258个加利福尼亚野蝽标本进行了测量。在这些标本中，79个个体在海拔2700 m以上的地方采集，与BC_HM类群相似(附加文件2:表S15和附加文件3:表S20)。我们的结果表明，叶片性状在所有个体之间表现出显著的变异，变异系数(CV)大于20%被认为是高的(附加文件2:表S15)。在研究的8个性状中，发现3个性状(叶长、叶形和叶齿密度)在高海拔(标本≥2700 m)和低海拔(标本< 2700 m)标本之间存在显著差异(附加文件1:图S9和附加文件2:表S15)。此外，叶长、叶齿密度、叶齿数三个性状与海拔高度呈弱相关(0.15 < |r|≦0.3,p值< 0.01，图4)。而叶长宽比与海拔高度呈强负相关(r = -0.53, p值< 2.2 -16，图4)。椭圆傅立叶描述子和58个完整叶片的主成分分析(EF-PCA)显示，叶长与叶宽的比值可以解释75.31%的叶形变异(PC1)(附加文件1:图S6)。上述结果表明，海拔高度显著影响白杨叶形的变化，而叶长宽比是影响白杨叶形变化的关键因素。生态位模型(ecological niche modeling, ENM)分析的目的是了解两个国家范围内的加利福尼亚白杨对过去气候变化的响应是否不同。采用生态位同一性检验方法，对两个海拔高度的白杨生态位差异进行了检测。所有ENM模型均具有较强的预测能力，曲线下面积(AUC)均超过0.95。当前条件下的预测分布范围与两个海拔高度的实际分布范围相匹配(附加文件1:图S10)。ENM结果显示，在LIG期间，高海拔和低海拔种群的地理范围与当前范围相比都缩小了(附加文件1:图S10)。LGM期间高海拔种群的预测分布是向南扩展的(附加文件1:图S10)。相比之下，预测的低海拔种群分布在LGM期间有向四川盆地迁移的趋势(附加文件1:图S10)。Schoener’s D和War-ren’s I的预测值与实测值之间的差异表明，两个海拔范围内种群之间存在显著的生态位差异(p < 0.01;附加文件1:图S11)。通过重建铁破椤的系统发育关系和种群结构，揭示了该属异域分化的复杂过程。与铁破椤最密切相关的属是日本特有的Anemonopsis。然而，B. calthifolia和B. del- tophyla之间的遗传分化发生在晚中新世前后铁破椤总地理范围的西端(图1b和2g)。随后，在上新世中期左右，位于该范围另一侧的B. calthifolia BC1(都江堰)种群与其他同种种群发生分化(图2)。biogeobars的结果表明，所有这些差异都是变异事件的结果，这表明从喜马拉雅山脉东部到中国中部相对较低的海拔地区，可能存在一个广泛分布的铁破椤祖先物种(图2)。我们发现都江堰种群保留了与三角藻共同的祖先多态性，这一点在我们的结构分析中得到了K = 2和3的证明(图2a和b)。在都江堰种群和三角藻之间检测到非常小的历史基因流(Nm)，这两个群体在地理上是隔离的。因此，这两个群体的遗传相似性可能是由于这一广泛分布的祖先物种在相对较低海拔地区保留了祖先多态性(附加文件2:表S12)。除此之外，种群BC_LS (= 2640 m)与BC_SC群(< 2200 m)相比，其相邻种群BC_HM群(> 2700 m)保留了更大比例的共同祖先多态性(图2b和c)。这些地理上孤立的谱系的遗传相似性可能是由于古代广泛分布的栖息地破碎造成的铁破椤始祖在横断山脉海拔较低的地区。低海拔大钟花种venosus和lushuiensis的异域分布格局也非常相似，它们形成于两个孤立的区域[30]，但这两个物种仍然生长在相似的栖息地。这些遗存谱系通过保留其最近共同祖先的生态位而在不同的低地地区被隔离。这些古老的异域生物由于有限的基因流动，谱系包含非常大量的私有等位基因(附加文件2:表S5)。因此，遗传漂移可能在它们的分化过程中发挥了重要作用。异域分化在大钟花的物种形成和/或分化历史中也发挥了重要作用(图2)。该物种在晚中新世(6.28 Ma;图1d和2h-m)。尽管M. stylophoo -rus所处的海拔高度要高得多，但该物种与其他两个物种的分布在很大程度上是异源的，而且它们之间的历史基因流非常有限，因此该物种的最初分离可能是由异源分化造成的。在最初的分化之后，在横断山脉和东喜马拉雅山脉之间发现了明显的种内分化(图2h-m)。由于同一生境类型在整个中喜马拉雅地区高度碎片化，因此在不同的孤立区域可以保存遗存谱系或物种。研究发现，这两个属的异源性分化主要发生在同一海拔范围内，并主要发生在四川盆地周边山区、云南西北部(特别是高黎贡山及其附近地区)和东喜马拉雅3个不同的地点。由于现代亚洲季风系统及其特殊的地理位置，这些地区在过去几百万年可能都具有相对低海拔的稳定湿润气候。这三个地区被周边的高山、炎热的干燥山谷或低海拔经历季节性干旱的地区相互隔离，这可能加速了许多温带类群的异域分化，这些类群倾向于湿润气候[38,39]。湿润地区的历史破碎化和中间地区剧烈的地质变化(如高山山谷的地貌形成)可能导致早期分化的物种(谱系)或姐妹物种(谱系)在分布区域的两端持续隔离的现象。铁破椤的异域分化在分布区的两端依次发生。中心分布区的BC_HM类群是铁破椤中较年轻的进化谱系，海拔最高(图1b和2g)。茎尖大钟花也分布在海拔较低的两种大钟花之间的区域，并占据该属的最高海拔。这种模式也可以在另一个东亚特有属Rodgersia[40]和一个重要的有利于潮湿生境的树群Tsuga[41]的异域分化中发现。在这些属中，中部地区(如横断山脉和云南高原的几个山脉)的种(系)由于剧烈的地质和气候变化而发生了适应性变化，这些变化可能产生了年轻的种或系。中部地区剧烈的地质变化和植被演化也可能导致局部物种灭绝。一些适宜湿润生境的温带植物种或类群，如珙桐(davida involucrata)、大花菊(Dickinsia hydrocotyloides)、大花叶菊(Dicentra macrantha)和紫菀(Asteropyrum peltatum[42])，在高黎贡山或其附近地区均有相同的破碎断裂。但主要分布范围均为四川盆地周围湿润地区。这些物种的这种分离模式可能与云南广泛的不适宜生境(如松林)和季节性干旱有关。云南的历史植被可能与亚洲季风的强度密切相关。当亚洲季风在上新世晚期较弱时，湿润生境可能变得更加破碎化，导致有利于湿润气候的温带类群局部灭绝或适应性变化。在东喜马拉雅山脉和横断山脉之间(两个铁破椤种之间或M. stylophorus种内部)，发现了铁破椤和大钟花之间的另一个明显的分离模式。许多其他温带分类群，如Maddenia、Rodgersia[40]和Roscoea[19]，也表现出类似的区域断裂或碎片化分布。有趣的是，即使是一些耐旱物种也可以在东喜马拉雅山脉和横断山脉之间呈现碎片化分布。我们认为怒江与雅鲁藏布江之间曾经存在着重要的生物地理界线。这一边界可能与该地区的地质事件密切相关，如雅鲁藏布江的历史河流捕获[45,46]。此外，在Roscoea山带研究中，提出了喜马拉雅山脉与横断山脉之间的生态屏障。图4基于258份样品铁破椤性状与海拔相关性的线性回归分析。(a):叶长(cm)， (b):齿数，(c):叶宽(cm)， (d):周长(cm)， (e):叶形状(以叶长与叶宽之比表示)，(f):齿密度(以齿数除以周长计算)，(g):叶面积(cm2)，(h):叶柄长度(cm)。左上角的数字是各性状与海拔高度之间的相关系数(r)及其显著性(p值)。红色字体表示相关性显著强(|r| > 0.3, p值< 0.01)。随着时间的推移，生态适应可以在物种分化中发挥作用，但它可能不是初始分化过程的主要原因。相反，它可能是长时间异域分化后出现的一种结果。但生态分化可以降低后续基因流动的影响，无论是在同域或次生接触[47]的情况下。虽然我们没有证据表明生态过程直接触发了大钟花和铁破椤的早期物种形成或分化，但生态分化确实促进了这两个属的后续谱系或物种多样化。在我们的研究中，M. stylophorus 和两个低地物种占据了两个明显不同的生态位，并且具有不同的进化过程不同的形态特征[30];在女山山区，M. stylophorus 与 M. lushuiensis 虽不对称分布，但可共存。生境分异可能是导致M. stylophorus与低海拔物种持续分化的重要因素。我们之前的研究发现，许多具有响应缺水和其他外界刺激功能的基因在M. stylophorus和 M. lushuiensis[30]之间都处于正向选择状态。根据分子测年分析，大钟花的初始分化发生在中新世晚期(图1d)。这一时期恰逢东亚季风强烈[48,49]，横断山区构造活动加剧[50-56]。这种构造活动和横断山脉高寒河谷的出现，使得许多低地地区变成炎热的干谷，不适合大钟花的生存[57,58]。同时，由于季风的强化在高海拔地区带来了丰富的水分，许多物种能够通过适应性进化[15]在高海拔环境中定居下来。横断山区BC_QCS类群与其他铁破椤类群的持续分化应与生境分异有关。BC_QCS类群和BC_SC类群的种群可以在邛崃山区共存，甚至可以在很近的距离内发现，但它们占据不同的海拔高度，出现在不同的植被类型中。如上所述，BC_QCS种群生长海拔相对较低，主要生长在常绿阔叶林的林下，这与三角藻相似。横断山区的其他类群生长在落叶林或针叶林的林下。除BC_QCS类群外，其余3个calthifolia类群在海拔梯度上均受到生态分化的影响，尽管铁破椤在整个分布范围内表现为距离隔离模式(图4)。我们通过结构分析和PCA分析确定了4个Beesia calthifolia类群(图2a-e)。其中，BC_HM、BC_LS和BC_SC是基于所有数据集的三个独立谱系(图1和2以及附加文件1:图S1)。遗传距离与气候、地理或海拔距离之间的Mantel检验和部分Mantel检验结果表明，海拔隔离是BC_HM、BC_LS和BC_SC类群遗传差异的主要原因(图3e)。我们还发现高海拔和低海拔种群之间存在显著的生态位差异，这一点通过生态位同一性测试得到了证明(附加文件1:图S11)。生物和非生物因子沿海拔梯度的变化会产生强烈的选择压力，从而导致形态特征的临床差异[59-62]。叶子是植物结构的关键组成部分，也是光捕获、气体交换和温度调节的媒介[63]，尤其容易受到这种变化的影响。研究表明，叶片形状和叶绿体进化有助于植物适应高海拔环境[63-65]。我们对标本的测量显示，不同遗传谱系的叶片形状与海拔梯度密切相关(图4e)。具体来说，我们发现不同海拔的群体具有不同的叶片形状(图4e和附加文件1:图S6)。叶片性状是反映海拔或纬度梯度变化的经典功能性状，通常与当地气候环境直接相关[62,66]。这种关系及其潜在机制在分子生物学和大规模生态学研究中得到了广泛的研究[67-69]。因此，叶片形状在海拔梯度上的逐渐变化可能表明了对不同环境条件的适应。此外，由于叶片形状是一种可塑性性状，我们在昆明植物研究所进行了初步的普通园林移植，观察BC_HM、BC_LS和BC_SC类群叶片形状的变化。我们观察到BC_HM组移植时单叶边缘呈凹形，而BC_SC组和BC_LS组的叶片生长正常。这表明，叶性状的分化可能是基于遗传的。然而，为了得到更明确的结论，未来仍需要严格的普通园林或移植实验来证实这一初步发现。根据分子定年，BC_HM组与BC_LS组在更新世早期发生分化(图2)。更新世时期存在大量冰期，促使植物在山区进行垂直迁移[8,58]。因此，在这些冰期循环中，孤立的加利福尼亚白杨种群可能会经历不同的选择压力。与此同时，不同海拔的加利福尼亚枝的周边环境差异也导致了对快速气候变化的不同响应。从生态位模拟结果来看，高海拔支系在LGM期间的分布有明显的向南扩展，而低海拔种群则倾向于向低海拔地区迁移(进入四川盆地)。这种在冰期旋回期间的持续隔离可能进一步加强了高海拔和低海拔演化支之间的分化(附加文件1:图S10和图S11)。我们发现，在铁破椤和大钟花地区，高海拔的类群与相对低海拔的类群在很大程度上是异域的。低海拔适宜栖息地的丧失可能迫使这些种群向上游迁移。一些种群可能移居到其他地方间冰期或强烈亚洲季风期高海拔潮湿地区，但在低海拔仍然适宜的地区，残存种群可能保存在低海拔地区。在中喜马拉雅地区，同时存在的异域隔离和海拔隔离可能促进了温带植物类群的物种形成或种内分化(图5)，特别是那些对栖息地有非常特殊要求的植物类群。我们认为，在铁破椤和大钟花中观察到的复杂分化模式适用于中喜马拉雅地区许多其他温带植物类群。然而，一个植物类群的分化过程和地理范围演化受多种因素的影响。不同的植物类群可能具有不同的生命历程、栖息地偏好、种群特征，并经历不同的构造和气候事件[70]。即使是铁破椤和大钟花在分化过程上也有明显的不同，如大钟花的生态分化更早、更突然。有时，由于生态位保守性强，某些类群的分化事件可能以异域分化为主，例如极端生境中的植物类群。此外，一些分类群可能涉及更复杂的进化历史，例如由于广泛杂交[71]、多倍体化或其他未揭示的过程而导致的辐射多样化。我们的研究强调，不同海拔的生境破碎化和生态适应可以共同推动山区植物类群的分化。这些地区的植物类群更容易受到环境异质性和物理屏障的隔离，导致生境破碎化和异域分化(IBD)。不同的孤立种群可能经历不同的选择压力，也有不同的生态机会，导致它们殖民新的生态位(IBE)。有时，栖息地破碎化和生态分化会相互作用。一个过程的影响可能会被另一个过程放大。由于强烈的遗传漂移和分化选择，山区的不同种群或群体可以迅速建立生殖隔离。这种IBD IBE的综合效应可能是导致中喜马拉雅地区植物类群分化的一个广泛因素。通过对铁破椤和大钟花的比较研究，发现山区植物类群的分化主要是由于不同海拔的生境破碎化和生态适应的共同作用。在这些地区，环境异质性和物理障碍的存在可能导致隔离，从而导致栖息地破碎化和异域分化。此外，孤立的种群可以经历多样化的选择压力和机会，从而导致新的生态位的殖民化。这些过程可以相互作用，相互放大，最终通过强烈的遗传漂移和分化选择，导致生殖隔离的建立。虽然不同植物类群的地理隔离和次生生态分化的相对贡献不同，但在中喜马拉雅地区，这两个因素的结合是常见的。图5 喜马拉雅地区生态分异外部影响因素示意图。顶部的图表显示了初始的异域分化。左边的两张图显示了更新世由气候动力学引起的植物垂直运动。右边的两张图显示了构造活动和地质事件，包括隆起、侵蚀和历史河流捕获，这些活动和地质事件可以形成新的和孤立的栖息地，导致生态分化。不同的颜色层表示与海拔相关的植被带。蓝色区域表示冰盖。小花的图标代表种群。不同颜色的图标代表不同的物种为了研究铁破椤和大钟花的种群遗传学，从加利福尼亚Beesia的12个地点和三角洲B. deltophyla的3个地点采集了119份样本，从venosus的1个地点采集了10份样本，从lushuiensis的一个地点采集了14份样本。stylophorus 13个地点共采集131个样本(附加文件2:表S1和表S2)。采集样本时，确保每个地点任意两个采样个体之间的距离大于10 m。采集叶片样品，硅胶干燥提取DNA，各位点凭证存放于中国科学院昆明植物研究所植物标本室。所有样本均采用ddRAD-seq(双消化酶切位点相关DNA测序)进行群体遗传分析。由于在本研究之前没有关于这两个属的突变率的文献，我们选择了16个铁破椤和16个大钟花个体，并结合之前发表的数据进行分子测年分析。为了估计不同种群或物种之间的分化时间，我们使用了化石记录和二次校准的组合。对于大钟花，使用核糖体内转录间隔(nrITS)和两个叶绿体标记atpB-rbcL和trl - trnf获得[29]和[30]的分子定年数据集。对Beesia用10个种群的13个个体和3个种群的3个个体进行系统发育关系的鉴定。我们组装了这些铁破椤样本的叶绿体基因组，并提取了蛋白质编码基因序列(cds)，用于系统发育分析和分子定年。构建成对的150 bp文库，在Illumina HiSeq 2000平台上对Beesia进行测序，每个样本产生约3gb的数据。过滤掉低质量reads后，使用GetOrganelle v1.7.1管道[72]组装整个叶绿体基因组序列。在该管道中，从总测序数据中提取质体基因组reads，并使用SPAdes version 3.10进行组装[73]。将kmer值设置为127、115、105和85。以已发表的Beesia calthifolia (MK253467)[35]叶绿体全基因组为参考，在PGA软件包中进一步注释这些序列[74]，然后在遗传 8.2.4中手工检查[75]。我们还从[35]下载了Cimicifugeae的叶绿体序列作为外群(Additional file 2: Table S9)。然后用遗传8.2.4提取叶绿体cds。使用MAFFT v 7.308进行基质比对[76]。采用BEAST v1.84[77]进行分子定年分析。铁破椤的二次校正设置遵循[35]的结果，限定了Cimicifugeae科的树冠年龄(26.57 Ma)和Beesia和Anemonopsis的茎龄(6.4 Ma)。核核苷酸置换的最佳拟合模型为GTR I R，使用jMODELTEST v 2.1.7估算[78]。对于大钟花，化石-化石校正设置遵循Favre et al. (2016) b[29]，限制了丽石属(Lisianthius)的茎龄(35.21 Ma)和龙胆属(Gentiana sect. Cruciata)的冠龄(6.25 Ma)。大钟花BEAST分析中核苷酸取代的最佳拟合模型与[30]给出的模型相同。使用出生-死亡不完全采样树先验，在BEAST中进行初始10%周期的burn-in。分析运行了10步-8马尔可夫链蒙特卡罗(MCMC)步骤。将MCMC样本导入TRACER v1.5(可从http://beast.bio./Tracer获得)，以检查链对平稳分布的采样充分性和收敛性。结果在FIGTREE v1.3.1(可从http://tree.bio./software/figtree/获得)中进行可视化和绘图。基因组DNA提取使用植物基因组DNA试剂盒(天根生物技术公司，北京，中国)按照试剂盒方案。限制性内切位点相关DNA文库的制备遵循一种通用且简化的被子植物ddRAD文库方法，命名为MiddRAD[79]。总基因组DNA (20 ng)用MspI (New England Biolabs, NEB， #R0106L)和AvaII (New England Biolabs, NEB， #R0153L)在37℃下用20µl反应体积用1x CutSmart缓冲液(New England Biolabs, NEB， #B7204S)缓冲3小时。严格按照MiddRAD协议构建了400 ~ 600 bp的片段库。Illumina HiSeq X Ten (San Diego, CA, USA)测序平台(PE150)在Novogene Co.(北京，中国)进行测序。过滤后的干净reads通过Stacks 2.0 Beta 8软件流水线进行处理[80-82]。首先，通过P1条形码对读取进行解复用，去除低质量读取(-c， -q， -r)。然后使用Fastp[83]对低质量碱基进行裁剪。第一次读取在3 '端裁剪了11 bp，在5 '端裁剪了10 bp，第二次Reads在3 '端和5 '端分别被修剪了20 bp和10 bp。然后使用denovo_map.pl对这些修剪过的reads进行组装。参数m表示创建堆栈所需的最小读次数;M表示堆栈之间允许的最大数目距离;n表示位点之间允许的最大不匹配数。通过系统地改变M和n从1到6 (M = n)，并将M设置为恒定值3，探索了各种参数组合。在80%的个体中发现的多态性位点数量的最大值被使用(参数设置:m = 3, m = 4，大钟花n = 4;m = 3, m = 5, 铁破椤为n = 5)。下游群体遗传分析数据集由POPULATIONS模块和PLINK v.1.07生成[84]。每个RAD位点在每个种群中至少有50%的个体存在(-r 0.5)，并且每个种群(数据集B119为- 15，数据集M155为- 12，数据集M131为- 10)被保留，并且对于每个位点，未链接的SNP被保留(- write_single_snp)。最后，我们使用PLINK过滤掉小等位基因频率< 0.01和缺失基因型> 0.3 (- maf 0.01)的位点-geno 0.3)。输入文件通过斯塔克斯和PGDSpider[85]中实现的populas - tions程序进行转换，以便进一步分析。我们使用STRUCTURE 2.3.4[86]来检测样本之间的底层总体结构。在1到10的范围内，对每个k值进行10次独立运行，5 x 10-5老化长度和10-6迭代。STRUCTURE收割机[87]采用delta-K法选择最佳k值。我们使用CLUMPP 1.1版本[88]对10次独立运行的系数取平均值，并使用DISTRUCT[89]绘制输出。主成分分析(PCA)由Bioconductor软件包SNPRELATE进行[90]。在RAxML 8.2.12[91]中使用最大似然方法重建系统发育，其中有1000个bootstrap重复。分配了具有获取偏差校正(—asc-corr = lewis)的GTR GAMMA模型的替代模型。成对FST和遗传多样性(包括private sites;观察到的het-erozygosity, Hobs;核苷酸多样性，π;FIS)是由斯塔克斯的POPULATIONS项目估算的。我们使用MIGRATE-N 3.6.11软件来估计种群和物种之间的历史基因流量(Nm)[92]。该软件利用贝叶斯推理策略，根据遗传数据推断种群的迁移率和分化时间。在我们的分析中，我们使用了三个SNP数据集，并设置了以下参数:500,000访问的参数值(记录的步骤= 5000，增量= 100，并发链数= 1)，老化期为10,000。利用BioGeoBEARS对Beesia和mega密码子进行了祖先范围重建[93]。我们采用了三种分析方法:分散-灭绝-枝原生成(DEC)、BayArea的似然版本(BAYARE-ALIKE)和分散-差异分析的似然版本(DIVALIKE)。每个分析都是利用从上述BEAST分析中获得的时间树，在有和没有j参数的情况下进行的。对于大钟花，由于大钟花外群的不确定性，将外群排除在外。莲花升麻 Anemonopsis被保留，因为这个属与铁破椤最密切相关。根据大钟花分布现状，划分了4个生物地理区域:(A)东喜马拉雅;(B)女山庐水;(C)横断山;(D)中国中部。除上述4个区域外，还确定了2个铁破椤和莲花升麻的生物地理区:(E)四川盆地附近的都江堰;和(F)日本。使用AIC标准确定了最适合的生物地理模型。I距离隔离(IBD)、海拔隔离(IBE)和气候距离隔离(IBC)分析为了研究铁破椤和大钟花群体遗传分化的驱动因素，我们使用R[95]中的vegan函数mantel[94]对遗传距离(以成对FST)表示)与气候、海拔或地理距离进行了Man-tel检验。我们还进行了部分Mantel检验，使用Pearson系数控制这些距离矩阵。每个突变都被设置为99,999。地理距离由geographical distance Matrix gen -tor v. 1.2.3 (https://biodiversityinformatics./open_source/gdmg/index.php)基于每个采样点的GPS读数生成。从WorldClim数据库(https://www)中提取19个生物气候因子，通过PCA得到前两个pc的欧几里得距离，计算气候距离。worldclim.com/)由R.中的栅格包计算，海拔距离用每对种群间海拔差的绝对值表示。加利福尼亚Beesia生态位建模及生态位同一性试验我们根据海拔阈值将收集到的植物和植物标本室记录分为两类。高海拔分布(2700 m以上)的类群对应于我们研究中的BC_HM类群，而分布在相对较低海拔的类群对应于BC_SC类群、BC_LS类群和BC_QCS类群。在剔除重叠位点后，我们确定了高海拔组16个栖息地位置，低海拔组26个栖息地位置。利用WorldClim提供的生物气候变量，估算了铁破椤在LIG和LGM现在的潜在分布范围。为了减轻共线性的影响，我们排除了Pearson相关系数r≥0.85的生物气候变量[96]。在排除具有高Pearson相关性的生物气候变量后，高海拔组保留了8个变量(即BIO1、BIO2、BIO3、BIO7、BIO12、BIO14和BIO19);附加文件2:表S18)和6个低海拔组(即BIO1、BIO2、BIO4、BIO12、BIO13和BIO15);附加文件2:表S19)。我们使用MaxEnt 3.4.4[97]进行分布估计，使用默认设置和特定参数:随机测试(25%)、训练(75%)、正则化乘数(1)、最大迭代(5000)、收敛阈值(0.00001)、最大背景点(10,000)和10个bootstrap复制。使用接收者工作特征(ROC)曲线的AUC来衡量模型的准确性。输出被重新分类以进行可视化，高适合度设置为> 0.4。对于不同海拔下加利福尼亚Beesia分布的生态位同一性检验，我们采用Schoener 's D[98]和Warren 's I[99]指数，其取值范围为0(无重叠)到1(等适宜性)。使用ENMTools v.1.4.4[100]，具有100个伪重复的生态位同一性测试提供了预期的指数值。我们应用非参数蒙特卡罗测试来比较观察到的指数和期望指数，p < 0.01表明区域之间的环境生态位不相同。我们从CVH (http://www./)下载了含有海拔信息的Beesia标本图像，并使用ImageJ测量了表型。然后，我们从每个标本图像中测量了259个最大的完整叶片(叶宽、叶长、叶柄长、叶面积和叶周长)。使用R版本3.5.2进行统计分析[95]。为了研究海拔对品种间叶片形状主成分得分的影响，采用SHAPE软件[101]进行EF-PCA，该软件包括ChainCoder、Chc2Nef、PrinComp和PrinPrint程序。选择58张不同海拔标本的完整叶片图像，使用Windows Paint将其转换为位图格式。然后我们按照SHAPE手册操作。在Chc2Nef中，我们选择基于最长半径的规范化来手动规范化形状。利用PrinComp和PrinPrint对系数的前20次谐波进行叶形近似。在R[95]中实现了PCA。 文章标题： Ancient allopatry and ecological divergence act together to promote plant diversity in mountainous regions: evidence from comparative phylogeography of two genera in the Sino-Himalayan region 作者信息： Junchu Peng , Xiangguang Ma, Hang Sun*
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