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作者：黄明聪，南京农业大学硕士在读，主要从事秸秆高值化利用方向秸秆高效降解菌群的筛选研究。 周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍TCA循环缺陷型大肠杆菌如何作为好氧发酵的有效底盘微生物，原文于2024年3月发表在《Nature Communications》上。 
三羧酸循环 (TCA循环) 在异养细菌的好氧生长过程中发挥重要作用，理论上消除TCA循环可以减少碳的损耗，促进化学物质的生物合成。构建TCA循环缺陷型的大肠杆菌作为化学物质生物合成的通用底盘菌株，首先利用适应性进化试验恢复TCA循环缺陷型大肠杆菌在基础培养基中的好氧生长，其琥珀酸脱氢酶失活是其进化的关键。通过替换内源性琥珀酰辅酶A依赖性酶，获得优化的TCA循环缺陷型大肠杆菌菌株。作为验证，通过改造该菌株实现了4种化学物质的高产。本研究增强了对TCA循环影响大肠杆菌代谢的理解，证明了TCA循环缺陷型大肠杆菌菌株用于生物技术应用的优势。1.TCA循环缺陷大肠杆菌在ALE后的生长恢复 对TCA循环缺陷型的大肠杆菌菌株Dtca(BW25113ΔaceAΔsucAΔgadAΔgadBΔpoxB::acs) 进行适应性进化试验，以恢复其在葡萄糖基础培养基中的好氧生长。dTCA菌株丢失了TCA循环的一个关键基因，其用于编码α-酮戊二酸脱氢酶 (ΔsucA)。丙酮酸氧化酶基因poxB被乙酰辅酶A合成酶基因acs所替代 (ΔpoxB::acs )，这种条件下，由乙酰辅酶A形成的乙酸被转化回到乙酰辅酶A库中。通过连续48 d的进化试验，最终细菌恢复了在葡萄糖基础培养基中好氧生长的能力，得到的两个进化终点菌株 (dTCA-E1，dTCA-E2),其生长速率与对照菌株iTCA相似，具有完整的TCA循环 (图1a)。dTCA-E1在对数期的乙酸盐产率显著高于iTCA菌株 (图1b)。重复ALE时，结果类似，两个进化终点菌株 (dTCAE3， dTCA-E4) 具有相当的生长速率和增加的乙酸盐产量 (图1a，b)。所有进化终点菌株的生物量产量显著低于iTCA菌株 (图1c)，而这4种进化菌株的葡萄糖摄取速率显著高于iTCA菌株 (图1d)。
图1.当引入琥珀酸脱氢酶突变时，TCA循环缺陷型大肠杆菌菌株dTCA在葡萄糖基础培养基中表现出好氧生长能力恢复 2.进化大肠杆菌菌株编码TCA循环酶的基因突变 对进化终点菌株和未进化的dTCA菌株进行全基因组测序和突变分析，揭示生长恢复的机制。结果显示，TCA循环酶编码基因中存在常见的突变 (图1e)，在4个进化终点菌株中，均发生了琥珀酸脱氢酶亚单位A (sdhA) 和柠檬酸合成酶 (gltA) 编码基因的突变，并且4个进化菌株的裂解液中未检测到显著的琥珀酸脱氢酶活性 (图1f)。与对照菌株iTCA相比，柠檬酸合成酶活性明显减弱 (图1g)。这些结果表明，琥珀酸脱氢酶失活和柠檬酸合成酶活性减弱对于TCA循环缺陷大肠杆菌的生长恢复至关重要。为检验这一假设，在未进化的TCA循环缺陷型原始菌株dTCA中敲除sdhA，并用确定的gltA突变体替换gltA。如图1h所示，sdhA的敲除足以恢复好氧生长，虽然单独的gltA突变不能恢复dTCA菌株的好氧生长 (图1h)，但它们确实显著改善了dTCA ΔsdhA菌株的好氧生长速率 (图1i)。这些结果表明，琥珀酸脱氢酶失活对于TCA循环缺陷的大肠杆菌的生长恢复是必不可少的，而柠檬酸合成酶的衰减是有益但并非必要。3.进化TCA循环缺陷型大肠杆菌的代谢重组 为了阐明进化的TCA循环缺陷型大肠杆菌生长恢复的代谢机制，对进化的dTCA-E1菌株和完整TCA循环的iTCA菌株进行了13C代谢通量分析，结果揭示了中心碳代谢的重塑 (图2a)。在进化的dTCA-E1菌株中，从α-酮戊二酸到琥珀酰辅酶A没有检测到任何代谢通量，与sucA基因敲除一致 (图1f)。此外，与iTCA菌株相比，dTCA-E1中柠檬酸合成酶通量显著降低，与柠檬酸合成酶活性的减弱一致 (图1g)。在dTCA-E1菌株中，琥珀酰辅酶A仅从琥珀酸再生，而在iTCA菌株中，所有琥珀酰辅酶A均来自TCA循环中α-酮戊二酸的脱羧。与iTCA相比，dTCA-E1中琥珀酰辅酶A的再生通量较低，进一步表明这一步可能是细胞生长的代谢瓶颈。在dTCA-E1菌株中，仅有2.2%的碳通过TCA循环转化为CO2，远低于iTCA菌株 (图2b)。在进化株中观察到TCA循环通量模式的改变，同时还观察到上游代谢的重构。与iTCA相比，氧化磷酸戊糖途径通量在dTCA-E1中显著上调 (图2a)。因此，在dTCA-E1中，超过85%的细胞生长所需的NADPH是通过氧化磷酸戊糖途径产生，而在iTCA中不到40% (图2c)。在dTCA-E1菌株中，转氢酶通量可以忽略不计，而在iTCA中，转氢酶通量是合成NADPH的主要贡献者 (图2c)。dTCA-E1中乙酰辅酶A的糖酵解通量显著高于iTCA。糖酵解通量的增加和柠檬酸合成酶通量的减少，导致dTCA-E1代谢失衡，乙酸分泌增加。中心碳代谢的重塑也影响了能量的产生，与iTCA菌株相比，dTCA-E1通过底物水平磷酸化和乙酸产生中获得更多的ATP (图2d)，并显示出更高的ATP代谢效率。dTCA-E1的TCA循环既不直接产生ATP (图2d) ，也不产生NADH/FADH (图2e )，而是用于与氧化磷酸化耦合产生ATP。dTCA-E1菌株的葡萄糖摄取速率显著高于iTCA (图2a)。结果表明，在dTCA-E1中TCA循环对能量生成并不重要，而是通过中心碳代谢，有效重塑平衡ATP代谢。
图2.13C代谢通量分析揭示了重连的中枢碳代谢以对抗TCA循环缺陷 4.通过消除对琥珀酰辅酶A的需求来恢复生长 根据前面的试验结果，假设琥珀酰辅酶A供应不足是TCA循环缺陷型大肠杆菌在葡萄糖基础培养基中无法生长的原因。当TCA循环在α-酮戊二酸脱氢酶节点处被阻断时，琥珀酰辅酶A只能由琥珀酸合成，琥珀酰辅酶A的可用性与消耗琥珀酸的琥珀酸脱氢酶活性呈负相关。因此在适应性进化过程中，对琥珀酸脱氢酶的失活会产生强烈的选择压力。为此，探索了一种替代策略来规避琥珀酰辅酶A的要求。假设TCA循环缺陷型大肠杆菌生长瓶颈是由于琥珀酰辅酶A供应不足而导致蛋氨酸、meso-DAP和赖氨酸的生物合成减少。为了验证这一假设，在补充有琥珀酸或氨基酸混合物的葡萄糖基础培养基中培养Bw25113ΔaceAΔsucA。在两种培养基中，菌株均生长良好，并且比葡萄糖基础培养基中的菌株更快 (图3a)。在含有补充物质的条件下，菌株sdhCDAB基因位点未发现琥珀酸脱氢酶的基因突变。此外，在补充了氨基酸混合物的培养基中生长的BW25113 ΔaceAΔsucA菌株中，细胞内琥珀酰辅酶A水平显著低于在葡萄糖基础培养基中生长的BW25113 (图3d)。这一结果证明了琥珀酰辅酶A的不足是TCA循环缺陷型大肠杆菌生长停滞的原因。假设通过将枯草芽孢杆菌中的乙酰辅酶A依赖的酶引入大肠杆菌中，可以恢复TCA循环缺陷型大肠杆菌在葡萄糖微量培养基中的好氧生长。为了验证这一点，将枯草芽孢杆菌中用于合成蛋氨酸、meso-DAP和赖氨酸的乙酰辅酶A依赖途径引入大肠杆菌BW25113中，得到了大肠杆菌DDPYM株系 (图3b)。在DDPYM中敲除了TCA循环和乙醛酸分解途径相关基因，得到了DDPYMΔaceAΔsucA和DDPYMΔaceAΔsucABCD株系，其生长速率，明显高于株系BW25113 ΔaceAΔsucA，并且与DDPYM和BW25113相似 (图3c)。菌株DDPYM和DDPYMΔaceAΔsucA中琥珀酰辅酶A为1.75±0.73 nmol/g DCW和1.04±0.06 nmol/g DCW (图3d)，而菌株DDPYMΔaceAΔsucABCD (菌株ZH40)中的琥珀酰辅酶A水平太低，无法准确测定。这些结果证实，在TCA循环缺陷型大肠杆菌菌株中观察到的生长停滞确实是琥珀酰辅酶A供应受限的结果，而不是能量供应受限。简而言之，通过引入异质乙酰辅酶A依赖途径，大肠杆菌可以成功地在切断的TCA循环 (ΔaceAΔsucA和ΔaceAΔsucABCD)的情况下生长。
图3.TCA循环缺陷大肠杆菌在葡萄糖微量培养基中恢复好氧生长的策略 5.TCA循环缺陷型大肠杆菌作为高效的好氧发酵底盘微生物 为证明TCA循环缺陷型DDPYM可以作为好氧发酵的通用和高效的底盘菌株，而不需要琥珀酰辅酶A进行氨基酸 (甲硫氨酸、meso-DAP和赖氨酸) 生物合成，构建了缺失琥珀酰辅酶A合成途径的菌株ZH40 (DDPYM ΔaceAΔsucABCD) (图4a)。在以往工作中，使用TCA循环缺陷型大肠杆菌 (ΔaceAΔsucA) 通过过表达脱乙酰氧基头孢菌素C合酶 (DAOCS) 将青霉素G转化为G-7-ADCA。DAOCS在菌株ZH40中过表达，其可以在葡萄糖基础培养基上好氧生长。ZH40中DAOCS的蛋白表达类似于具有完整TCA循环的BW25113和DDPYM背景菌株中蛋白的表达 (图4b)。ZH40菌株的G-7-ADCA产量比BW25113和DDPYM背景菌株高3倍以上 (图4c)。通过在菌株ZH40中过表达磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和谷氨酸脱氢酶 (图4a)生产谷氨酸，ZH40-gdhA-ppc菌株在17h内获得了5 mmol/L的谷氨酸，而具有完整TCA循环的BW25113-gdhA-ppc和DDPYM-gdhA-ppc菌株中未检测谷氨酸(图4d)。为证明ZH40菌株也可以高效产生乙酰辅酶A衍生产品，从ZH40菌株中敲除了丙酮酸氧化酶基因，得到了ZH44菌株(DDPYM ΔaceAΔsucABCDΔpoxB)，该菌株只能从乙酰辅酶A产生乙酸。与具有完整TCA循环的大肠杆菌菌株相比，ZH40和ZH44菌株的乙酸产量和速率更高 (图4e)，同时其生长速率与BW25113和DDPYM相似。将ZH44的柠檬酸合酶突变为GltA (T109P），以减少乙酰辅酶A进入TCA循环，所得菌株ZH45 (ZH44 gltA (T109P)) 的生长速率、生物量产量、乙酸产量和乙酸生产率在指数生长期期间增加 (图4e)。在全细胞生物催化过程中，ZH40和ZH44中的乙酸盐产量进一步增加到0.96±0.01 mol/mol (图4f)，ZH45中的乙酸盐产量进一步增加到1.42±0.04 mol/mol，而在具有完整TCA循环的大肠杆菌菌株的培养物中没有乙酸盐积累 (图4f)。这些结果证明了缺陷TCA循环有利于对乙酰辅酶A生产化学物质。在全细胞催化阶段，静止细胞不生长，其中来自葡萄糖的代谢物产率用于分析代谢的分布 (图4f)，在具有完整TCA循环的菌株BW25113和DDPYM中，TCA循环脱羧导致葡萄糖的完全碳损失 (图4f)。然而，TCA循环缺陷菌株ZH40、ZH44和ZH45显示出碳损失的显著减少，超过70%的碳通量转移到乙酸盐和α-酮戊二酸(AKG）(图4f)。与菌株ZH44相比，菌株ZH45中柠檬酸合酶的突变导致AKG通量降低和乙酸通量增加 (图4f)。然而，这些TCA循环缺陷菌株ZH40、ZH44和ZH45也表现出超过20%的碳损失。与菌株ZH44相比，柠檬酸合酶突变导致菌株ZH45的碳损失适度增加 (图4f)。这些结果证明了TCA循环缺陷型DDPYM菌株在最大限度地减少碳损耗和促进化学物质生产方面的巨大潜力。
图4.使用TCA循环缺陷的大肠杆菌菌株对化学品进行高产生物合成 采用自适应进化实验方法，发现 TCA循环在α-酮戊二酸脱氢酶步骤被切断时生长缺陷的潜在机制，其限制因素不是能量限制，而是琥珀酰辅酶A供应不足，导致无法产生蛋氨酸、meso-DAP和赖氨酸。在大肠杆菌中，琥珀酰辅酶A只能从琥珀酸中生成，只有当琥珀酸脱氢酶发生突变，TCA循环缺陷型(ΔaceAΔsucA)大肠杆菌才有足够琥珀酸维持琥珀酰辅酶A库。通过表达异质乙酰辅酶A依赖性酶，绕过氨基酸合成中对琥珀酰辅酶A的需求，恢复TCA循环缺陷型大肠杆菌的生长，同时避免乙酰辅酶A在循环中不必要地氧化为CO2,减少了大肠杆菌中的TCA循环的碳损耗，增加了产物形成为导向的碳通量，提高产物产率。论文信息 原名：A citric acid cycle-deficient Escherichia coli as an efficient chassis for aerobic fermentations 译名：TCA循环缺陷型大肠杆菌作为好氧发酵的有效载体 期刊：nature communications DOI：10.1038/s41467-024-46655-4 发表时间：2024.3 通讯作者：林白雪研究院 通讯作者单位：中国科学院微生物研究所
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