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结果： 细胞通讯网络分析揭示了肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤细胞和淋巴细胞之间的促进肿瘤发展的相互作用考虑到4级胶质母细胞瘤（GBM）具有比低级别胶质瘤更具抑制性的肿瘤微环境（TME）[28, 29]，作者最初着重研究了两名低级别胶质瘤患者的TME。为此，作者分析了来自两名低级别胶质瘤患者的四个胶质瘤组织的公开可用的单细胞RNA测序数据集[26]。初步的质量控制检查显示出17,687个细胞，每个细胞的基因中位数为2,628个。作者使用统一流形近似和投影（UMAP）进行数据分析，以进行降维和聚类。观察到七个不同的细胞簇，分别为C0至C6簇（图1a）。大约40%的细胞位于C0簇，该簇高度表达微胶质标记物P2RY12和TMEM119，以及巨噬细胞标记物ITGAM（编码CD11b）、CD68和CD14。这个细胞群被称为C0-TAM（附加文件1：图S1a，b）。这与之前的研究结果一致，即TAMs是胶质瘤TME中显著的免疫细胞群体[43]。通过分析细胞类型特异性的经典标记物的表达情况（图中... 1b），作者将剩下的六个聚类分为以下几类：C1-胶质瘤-DLL3，表示具有高细胞表面表达的切割蛋白样配体3（DLL3）的胶质瘤表达；C2-胶质瘤-SPARCL1，指的是具有酸性富含半胱氨酸样蛋白1（SPARCL1）的表达升高的胶质瘤，这在癌干细胞中已有报道[44]；C3-少突胶质细胞；C4-胶质瘤-TOP2A，其特征是拓扑异构酶II-alpha（TOP2A）表达水平高，这表明肿瘤细胞正在增殖[45]；C5-内皮细胞和C6-淋巴细胞（图1a）。基于上述标记基因的手动注释（附加文件8：表S1）与通过ScType进行的自动化细胞类型评分具有高度一致性，ScType是一种数据驱动工具，通过全面的细胞标记基因数据库进行细胞类型注释（图1c和附加文件8：表S2）[46]。
单细胞RNA测序分析揭示了胶质瘤中异质的肿瘤相关巨噬细胞亚型为了研究胶质瘤中TAM的功能变异，作者以更高的分辨率对TME进行了表征，并根据独特的细胞标记物将其注释为13个不同的细胞簇（图2e，f）。在这些簇中，TAM群体（图1a中的C0簇）进一步分为三个子集，并命名为TAM-CCL3、TAM-AIF1和TAM-SPP1（图2e，f）。TAM-CCL3子集表现出相对较高的趋化因子相关基因表达，如CCL3、CCL4和CCL4L2，这些是活跃小胶质细胞的已知标记物（图2f和附加文件2：图S2a）[49, 59]。使用“fgsea”对TAM-CCL3子集与其他TAM子集中差异表达的基因进行的通路富集分析显示免疫激活通路富集（p < 0.05）。这些通路包括肿瘤坏死因子α（TNFα）信号通路、炎症反应、IL2和信号转导与转录激活因子5（STAT5）信号通路以及干扰素γ（IFNγ）反应，表明其参与抗肿瘤免疫应答（图2g）。TAM-AIF1子集表达了高水平的AIF1、C1QA、C1QB和P2RY12（图2f和附加文件2：图）。S2a），这些是活化和稳态小胶质细胞的标记物[60, 61]，表明这个群体由脑内小胶质细胞组成。另一方面，TAM-SPP1亚群的特征是SPP1、FTL、LAPTM5、S100A11的高表达（附加文件8：表S3）。SPP1是一种分泌的糖蛋白，由骨髓来源的单核细胞高表达，并且已知能够维持胶质瘤细胞的存活并刺激血管生成[62]。TAM-SPP1亚群还高表达脂质代谢基因，包括APOC1、APOC2和TREM2，这些是已知的脂质相关巨噬细胞（LAMs）标记物[63, 64]（图2e，f和附加文件2：图S2a）。通路分析表明，TAM-SPP1在血管生成、分解代谢和合成代谢通路中富集（图2h）。这意味着TAM-SPP1通过激活代谢通路利用肿瘤微环境中有限的营养物质，可能在调节代谢平衡和胶质瘤微环境内的血管生成中发挥作用（图2h）。
TAM亚型展示出不同的功能，并受到不同的转录网络调控然后，作者研究了TAM亚群如何发挥其抑制或促进肿瘤功能。在淋巴细胞簇中，表达了几种免疫检查点分子（图3a），包括CTLA4（编码细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4，CTLA4）、LAG3（编码淋巴细胞活化基因3，LAG-3）、PDCD1（编码程序性死亡-1，PD-1）和TIGIT（编码具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体，TIGIT）（图3a）。利用TCGA低级别胶质瘤患者的RNA测序数据，计算了免疫检查点的特征得分，包括CTLA4、LAG3、PDCD1、PD-L1、PD-L2和TIGIT，以及每个TAM亚群中的前五个标记基因。值得注意的是，免疫检查点的特征得分与TAM-AIF1和TAM-SPP1的标记物强烈相关（p < 0.0001，R = 0.77和0.72，分别）（图3b-d），这表明TAM-AIF1和TAM-SPP1可能在肿瘤微环境中促进T细胞耗竭。此外，肿瘤免疫功能障碍和排斥（TIDE）分析将T细胞功能障碍和T细胞排斥的表达特征整合起来，以预测免疫疗法的反应[65]。结果显示，与TAM-SPP1 high 患者相比，TAM-SPP1 low 患者更容易出现免疫疗法抵抗，其TIDE（p < 0.01）、T细胞功能障碍（p < 0.0001）和T细胞排斥得分（p < 0.01）更高（图3e）。相反，TAM-CCL3 high 患者的TIDE（p < 0.05）和T细胞排斥得分（p < 0.01）较低，与TAM-CCL3 low 患者相比（附加文件3：图S3a）。这些结果表明，TAM-SPP1在抑制T细胞中起主要作用，并可能成为预测胶质瘤患者免疫疗法反应的潜在标志物。
单细胞RNA测序分析揭示了代表性肿瘤相关巨噬细胞亚群与疲惫T细胞之间的相互作用通过上述分析，作者能够研究低级别患者中的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），而不受侵袭性高级别胶质瘤的干扰，从而确定了三个明显且易于区分的TAM亚群。为了确定这些发现是否适用于更大的数据集，并进一步阐明这三个明显的TAM亚群是否与胶质瘤的侵袭性有关，作者将分析扩展到了肿瘤级别，包括来自另外15名患者的122,626个细胞，其中包括4例3级和11例4级胶质瘤患者（图4a）。通过对单细胞RNA测序数据进行InferCNV分析，检测到大规模拷贝数变异，区分恶性细胞和正常细胞（图4b）。4级胶质母细胞瘤（GBM）和2-3级低级别胶质瘤（LGG）的肿瘤细胞具有不同的转录组特征，而它们的免疫细胞转录组特征相似（图4b，c）。对CD68 TAMs和淋巴细胞之间的所有显著细胞间通讯途径的检查（图4d，e）证实，SPP1和GALECTIN信号通讯主要负责TAMs和淋巴细胞之间的相互作用（图4f）。值得注意的是，与2-3级低级胶质瘤相比，4级胶质母细胞瘤（GBM）的TAM细胞表达了更高水平的SPP1（图4g）。然后，作者对17例不同级别胶质瘤患者的TAM亚群进行了聚类分析，并发现了三个主要的TAM亚群，分别具有CCL3、AIF1和SPP1的显著表达，这三个亚群与先前鉴定的2级胶质瘤中的TAM大部分标记基因相同（图4h、i和附加文件8：表S4）。有趣的是，AIF1 + TAM和SPP1 + TAM在4级GBM中明显更常见，而在2/3级胶质瘤中较少见（图4j）。
TAM-SPP1与胶质瘤患者的预后不良和生存状况较差相关在前一节中，作者强调了肿瘤和免疫细胞之间复杂的相互作用，并阐明了胶质瘤肿瘤微环境中TAM亚群的异质功能。为了在更广泛的范围内证实这些发现，作者采用了解卷积算法CIBERSORTx [78]来探索TCGA和中国胶质瘤基因组图谱（CGGA）数据集中低级别胶质瘤患者浸润免疫细胞的组成（附加文件8：表S5和S6）。首先，作者根据前面提到的七个细胞簇的单细胞基因表达构建了一个胶质瘤特异性参考矩阵（图2e），其中包括三个TAM亚群、内皮细胞、胶质瘤细胞、少突胶质细胞和淋巴细胞。随后，使用定制的基因-细胞参考矩阵来估计TCGA和CGGA队列的批量RNA-seq数据中七个细胞簇的丰度（附加文件4：图S4a）。批量RNA-seq数据成功解卷积，TCGA患者的中位相关性为0.817（SD = 0.097），CGGA患者的中位相关性为0.727（SD = 0.182）。
一个基于TAM签名的预测模型有效预测抗肿瘤免疫，并准确评估胶质瘤患者的风险此外，作者根据在Cluster 1和Cluster 2患者之间观察到的分子差异，为胶质瘤患者开发了一种预后模型（附加文件5：图S5a），这两组患者显示出不同的预后、免疫细胞浸润模式和抑制分子（图5i-k）。使用对数 2 折变化截断值为0.6，发现Cluster 1和Cluster 2患者之间有1959个基因差异表达。随后，通过单变量Cox回归分析发现，与患者预后显著相关的基因有1311个。为了进一步确定与患者生存相关的最关键变量，应用了最小绝对收缩和选择算子（LASSO）惩罚Cox回归分析，筛选出了17个基因。这17个基因经过随机森林算法排序（附加文件5：图S5b，c）。在前10个基因中，发现有4个具有最高预测性，包括APOBEC3C、EMP3、IGF2BP2和TGIF1（附加文件5：图S5c）。利用这四个基因，通过多变量Cox回归分析建立了胶质瘤患者的预后模型。
EGFR 扩增与抑制性 TAM 亚群和较高的风险评分相关 为了研究与免疫差异和患者预后相关的遗传改变，作者 分析了两个脑胶质瘤患者群体的体细胞突变谱。根据单核苷酸变异（SNV）分析，两个群体中的大多数变异是错义变异，Cluster 2 患者约有15,000个SNP，Cluster 1 患者少于8000个，主要是胞嘧啶到胸腺嘧啶的替代（附加文件6：图S6a，b）。显示了前20个突变基因的突变类型（附加文件6：图S6c，d）。在两个群体中，已知参与肿瘤发生的IDH1、TP53、ATRX、CIC和PIK3CA基因频繁发生突变。值得注意的是，Cluster 2 患者中有10%的患者观察到了EFGR突变，而在Cluster 1 患者中很少见（附加文件6：图S6c，d）。 
总结 作者的研究揭示了在胶质瘤中塑造免疫抑制微环境的分子和细胞机制，为潜在治疗靶点提供了新的见解。此外，开发的预后模型有望预测免疫疗法的反应，并协助对胶质瘤患者进行更精确的风险分层。
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