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题目：Host-induced gene silencing in wild apple germplasm Malus hupehensis confers resistance to the fungal pathogen Botryosphaeria dothidea 刊名：The Plant Journal 作者：Xinyi Yu, Shenchun Qu et al. 单位：Nanjing Agricultural University, Nanjing 日期：02 March 2024    01 摘要 
02 技术路线  Malus hupehensis was cultured in vitro with Murashige and Skoog (MS) medium Construction of vectors and transformation fungal culture, inoculation, and recovery Isolation of fungal protoplasts from infected tissue Gene knockout and knockin in B. dothidea TRV-mediated (a)miRNA overexpression and inhibition Y1H，Y2H，EMSA，BIFC、Dual-luc 03 主要结果 3.1 苹果miRNA可转运到B.dothidea 为了研究能够调节B.dothidea基因表达的苹果miRNA，我们使用来自miRbase的成熟序列进行了生物信息分析，以使用psRNATarget在B.dothidia基因组中识别候选靶点。来自30个miRNA家族的65个独特序列被预测为靶向173个与真菌生长、发育和可能的发病机制有关的B.dothidea基因座。 鉴于EV介导的转运在sRNA从植物传递到真菌中的重要性，我们从感染B.dothidea的M.hupehensis中纯化了EV，以检测可能调节B.dothidia基因表达的miRNA的存在。我们根据其典型的杯状结构证实了EV的分离，如通过负染色样品的透射电子显微镜观察到的（图1a）。 我们使用不同的特异性引物进行了逆转录定量PCR（RT-qPCR），并遵循以下标准：S形扩增曲线和Ct值小于或等于检测限表示阳性结果；没有S形扩增曲线并且没有Ct值表示负结果。 由于缺乏有效的EV sRNA内部参考，我们在RNA样本中以相同比例添加了一个21nt合成的片段作为外部参考（称为ExRef），该片段与任何已知的苹果或B.dothidea miRNA都不同源。同一miRNA家族的成员通常具有很高的序列相似性，很难通过特定的RT-qPCR引物进行区分；在M.hupehensis EV中检测到的可区分序列覆盖了多达20个家族（图1b）。我们检测了这些序列在从感染的M.hupehensis组织中回收的B.dothidea中的积累，以研究它们转移到入侵真菌中（图1c），并在回收的菌丝中检测到12个携带EV的miRNA家族，但在体外培养的对照B.dothidea中没有检测到（图1b）。这些观察结果有力地表明M.hupehensis miRNA介导的B.dothidea跨界RNAi的发生。
3.2 苹果miR159可能靶向B.dothidea基因 miR159是一种常见的植物miRNA家族，其被转移到相互作用的病原体中以调节其靶标。我们在感染的M.hupehensis和从感染组织中回收的培养的B.dothidea菌丝的EVs中检测到miR159（图1b）。苹果miR159家族的两个不同的miRNA序列，miR159a和miR159c，被预测为靶向B.dothidea中的16个转录物。这些靶标中的大多数没有通过50 RNA连接酶介导的cDNA末端的快速扩增（50 RLM-RACE）来验证。 然而，我们在从感染的M.hupehensis提取的B.dothidea中获得了GTA08_BOTSDO08863和GTA08_BOTSDO01331的切割产物，但在体外培养的B.dotsidea中没有获得，这精确地定位到预测的miR159a靶位点（图2a）。这两个基因分别编码真菌糖苷水解酶家族27（称为BdGH）和主要促进因子超家族（MFS）糖转运蛋白（称为BsTP）（图2b）。接下来，我们在本氏烟草中进行了共表达测定，以验证苹果miR159a对其真菌靶标的沉默作用。 我们将野生型（wt）BdGH和BdSTP或突变（m）版本的编码序列融合到b-葡萄糖醛酸酶（GUS）基因上，作为报告基因。由于miR159a和miR159c来源于苹果中相同的发夹结构，我们构建了人工miRNA前体（aMIRNAs），以在N.benthamiana中表达外源miRNA。当与GFP共同转化到N.benthamiana中时，含有野生型BdGH或BdSTP的报告子的表达水平低于含有突变miRNA抗性版本的报告子。由于N.benthamiana miR159与苹果miR159a具有相同的序列，我们认为这些观察结果是由于内源性miR159的干扰。 为了进一步验证这一概念，我们引入了miR166作为对照。这种miRNA的序列存在于植物中，被认为在植物与真菌的相互作用中调节病原体基因的表达。然而，根据靶标预测，B.dothidea基因组缺乏这种miRNA的结合位点，在M.hupe hensis EV中检测到了这种miRNA，但在入侵的B.dothidia中没有检测到。相对于与miR166或miR159c共表达的那些，与外源miR159a共表达的（wt）BdGH GUS或（wt）BsTP GUS的转录水平显著降低，而具有突变miR159a结合位点的重组GUS报告子在miR159a、miR159c或miR166共转化时以相似水平表达（图2c）。 重组蛋白的组织化学染色和酶活性测定产生了一致的结果，即共表达的外源miR159a抑制了与野生型但未突变的真菌靶标融合的GUS的表达（图2d，e）。这些数据表明BdGH和BdSTP是苹果miR159a的直接靶标，并经历特异性的mRNA切割。 在我们的psRNATarget分析中，miR159c被预测为靶向GTA08_BOTSDO04293，这是B.dothidea中一种推定的乙酰乳酸合成酶（ALS，EC 2.2.1.6）基因。BdALS与ILV2编码的真菌ALS催化亚基（CSU）同源，并含有ALS-CSU的N-末端和C-末端硫胺素焦磷酸酶（TPP）结合结构域特征。 BdALS的中段类似于其他ILV2蛋白的DHS样NAD/FAD结合结构域，但未被鉴定为CSU的典型TPP中心结构域（图2b）。由于ALS是生物杀虫剂和抗真菌药物的合适靶点，我们在共表达分析中检测了miR159c对GTA08_BOTSDO04293的切割，尽管这没有通过50 RLM-RACE验证。 当我们使用BdALS的重组GUS报告子时，与miR159c的共表达导致使用野生型BdALS抑制GUS表达，但不影响具有修饰的miRNA结合位点的突变版本，这表明miR159c通过互补碱基配对诱导BdALS沉默（图2c-e）。
3.3 miR159a在自然感染过程中对B.dothidea的跨界RNAi中的作用 为了确定苹果miRNA是否使其在B.dothidea细胞中的真菌靶标沉默，我们使用合成的miRNA/miRNA*双链体通过聚乙二醇（PEG）介导的B.dothidia原生质体转化将miR159a和miR159c导入真菌中。使用miR166作为对照，该miR166不靶向任何B.dothidea基因。我们将携带潮霉素抗性基因（hyg）和miRNA双链体的真菌表达载体与B.dothidea原生质体一起孵育。具有潮霉素抗性的转化体被认为已经吸收了miRNA。每个miRNA双链体的阳性转化体中至少有一半携带植物miRNA；我们传代培养三个随机选择的转化体（图3a）。在含有miR159a的亚培养物中，BdGH和BdSTP的转录水平显著降低。这种效应是特异性的，因为这两种转录物在含有miR159c的亚培养物中的水平没有改变（图3b）。 当检测BdALS的表达时，我们发现它在含有miR159c但不含有miR159a的亚培养物中被抑制（图3b）。在携带miR166的亚培养物中，BdGH、BdSTP和BdALS的转录水平没有改变，进一步证实了苹果miRNA对其各自真菌靶标的特异性沉默。这些结果支持了这样一种观点，即B.dothidea中的基因表达受到进口苹果miR159a和miR159c的调节，miR159a沉默BdGH和BdSTP的表达，miR159c沉默BdALS表达。 为了进一步探索miR159家族成员在B.dothidea中的易位，我们从感染的M.hupehensis组织中分离出真菌原生质体。我们还从体外培养的植物组织和B.dothi dea的混合物中分离出有趣的gal原生质体作为未电离的对照。在提取物中检测不到苹果持家基因EF-1a，这表明分离的真菌原生质体中不存在植物成分（图3c）。Northern印迹显示，miR159a在从感染的M.hupehensis分离的B.dothidea原生质体中积累，但在从体外培养的植物组织和B.dothidia的混合物中提取的原生质体中不积累（图3d）。可以合理地假设miR159a是通过EV途径从M.hupehensis转移到B.dothi dea的，因为来自受感染植物的EV比来自模拟接种植物的EV含有更高水平的miR159a（图3d）。 相比之下，在植物EVs或分离的真菌原生质体中未检测到miR159c，无论是否发生了B.dothidea定殖（图3d）。因此，miR159c不太可能在自然感染期间递送，这可能解释了使用BdALS的50 RLM-RACE测定的失败。值得注意的是，miR166在感染后在总植物组织和纯化的EVs中积累到更高的水平，但在斑点隐球菌定植中检测不到（图3d），这与回收菌丝的RT-qPCR结果一致。这些结果表明，miR159a是介导M.hupehensis与B.dothidea相互作用中跨界RNAi的主要sRNA。
3.4 miR159a对BdSTP的沉默削弱了B.dothidea的致病性 当监测BdGH、BdSTP和BdALS的表达时，我们观察到，与从植物组织和体内培养的B.dothidea作为对照的混合物中分离的真菌原生质体相比，从感染组织中分离的B.dothedea原生质体中积累的BdSTP转录物更少。相反，BdGH的转录水平在定植后增加；也许其转录是由病原体内源性调节的（图4a）。 BdSTP被认为是miR159a在自然感染过程中的主要靶点，因此我们将分析重点放在BdSTP上。为了评估BdSTP在B.dothidea中的作用，我们用抗生素抗性基因新霉素（neo）通过同源重组取代了其在B.dotsidea基因组中的DNA片段，以敲除BdSTP，这一点通过PCR分析（DSTP-neo）得到了证实。BdALS在体外被miR159c靶向，但在定植fun-gus中没有靶向，也以这种方式进行了分析（DALS-neo）（图4b）。 为了避免外源性neo的干扰，我们创建了含有通过2A肽序列（P2A）与neo融合的BdSTP或BdALS的敲除菌株作为对照（wtSTP-neo和wtALS-neo），其中靶基因和neo基因由单个内源性启动子驱动（图4b）。除了色素沉着相对减少外，体外培养的DSTP-neo在植物生长方面与wtSTP-neo没有明显差异，而BdALS的缺失导致生长中的缺陷。 重要的是，当用于接种M.hupehensis时，DSTP-neo和DALS-neo表现出受损的致病性，这反映在坏死病变扩展减少（图4c，d）和每个感染区域的相对真菌生物量减少（与宿主的生物量标准化；称为定殖系数，表示真菌定殖水平）（图4e）。接种DSTP neo的M.hupehensis的病变面积下降幅度不大，而DALS neo导致病变面积大大减少。这些数据表明，BdALS是B.dothidea生长和增殖及其毒力所必需的，而BdSTP可能仅是其生长和增殖所必需的。我们通过敲入与neo融合的突变BdSTP或BdALS（mSTP neo或mALS neo）构建了互补突变菌株（图4b）。相应突变体中的真菌基因不再能够被M.hupehensis miRNA靶向。与wtSTP-neo和wtALS-neo相比，具有突变（miRNA抗性）靶标的菌株在体外培养时的生长性能发生了显著变化。在致病性测定中，我们观察到接种mSTP neo的M.hupe hensis比接种wtSTP neo对照更严重的症状，并伴有病原体的快速增殖（图4c–e）。宿主易感性的增强可归因于真菌负荷的增加。与wtALS-neo相比，mALS-neo菌株中BdALS中miR159c靶位点的突变不影响症状发展或真菌在宿主中的定殖（图4c-e）。 我们测量了从感染（或仅与之混合）各种重组B.dothidea菌株的M.hupehensis分离的真菌原生质体中的BdSTP和BdALS转录水平，包括DSTP-neo、DALS-neo、mSTP-neo和M-ALS-neo，以及wtSTP-neo和wtALS-neo作为对照。正如预期的那样，在DSTP neo中无法检测到BdSTP的表达，在DALS neo中也无法检测到BdALS。虽然植物来源的miR159a在定植于M.hupehensis的所有六个B.dothidea菌株中积累到相似的水平，但mSTP neo菌株中的BdSTP转录物水平显著高于wtSTP-neo和wtALS-neo对照或DALS neo和mALS neo菌株（图4f，g）。 无论是否发生感染和定植，我们都没有在真菌原生质体中检测到miR159c，除DALS neo外，菌株之间的BdALS转录水平没有显著差异（图4f，g）。这些结果表明，miR159a诱导的BdSTP沉默削弱了B.dothidea的致病性，参与了促进M.hupehensis抗性的防御机制。
3.5 M.hupehensis对B.dothidea的抗性需要miR159a 我们的研究结果表明，M.hupehensis将miR159a传递到B.dothidea中，以阻止真菌入侵。然而，miR159a在受感染植物的总组织样本中的丰度低于模拟处理植物，而在接种后的植物EVs中其水平增加。 为了验证miR159a在M.hupehensis防御B.dothidea中的作用，我们监测了miR159a前体的转录水平，miR159c也由此产生，成熟miR159a的积累在接种后0小时开始。我们在接种后24小时（hpi）检测到MIR159转录物水平显著下降，随后逐渐增加，尽管72 hpi时的水平仍低于0小时时的水平（图5a）。成熟miR159a的积累在整个感染过程中持续减少（图5a），而成熟miR159c的水平保持较低（数据未显示）。 我们通过基于TRV的方法导入编码miR159a或miR159c的相应aMIRNA基因。在上部新叶中检测到病毒RNA表明TRV的成功传播。Northern印迹显示，与用空TRV载体（TRV:00）培养的对照植物相比，相应TRV渗透的植物中的miRNA水平发生了改变，TRV:aMIR159a和TRV:aMIR159c植物中miRNA水平增加，TRV:STM159a和TRV：STTM159c植物中的降低（图5b）。 在M.hupehensis中，miR159a或miR159c的几个预测靶标的表达水平发生了相应的变化。当用B.dothidea攻击时，过表达aMIR159a的M.hupehensis植物表现出与表达TRV:00的植物相似的易感性水平，在症状发育或真菌定殖方面没有显著变化（图5c-e）。这些结果与之前通过农杆菌介导的转移基因表达对过表达miR159a的B.dothidea侵染的结果一致。相反，通过STTM抑制aMIR159a在乳杆菌中的表达导致真菌载量显著增加，但宿主症状严重程度的变化不太明显（图5c–e）。然而，无论是过表达还是抑制miR159c，都没有显著改变M.hupehensis的抗性（图5c-e）。这些结果促使我们研究M.hupehensis中B.dothidea靶标的HIGS，其中miR159a或miR159c的表达是通过TRV操纵的。我们分析了这两种miRNA在感染期间TRV渗透植物的EVs中的积累，并确定miR159a的积累在TRV:aMIR159a植物中没有增加，但在TRV:STM159a植物中减少（图5f）。相应地，从TRV:aMIR159a植物的感染组织中分离的真菌原生质体中miR159a的丰度与TRV:00对照植物相似，但在TRV:STM159a植物中检测不到（图5f）。与定殖TRV:00植物的B.dothidea相比，定植TRV:aMIR159a植物的BdSTP转录水平没有显著降低，这与真菌细胞中miR159a的积累模式相对应，而定植TRV：STTM159a植物的B.dothiea的BdSTP转录水平与体外培养的对照相当（图5g）。 因此，B.dothidea在TRV渗透的植物中的定殖和由此产生的宿主损伤与B.dothidia细胞中miR159a的积累呈负相关，与真菌靶标BdSTP的转录水平呈正相关。我们没有检测到miR159c在任何感染的TRV渗透物的植物EVs或真菌原生质体中的积累，包括aMIR159c过表达的情况（图5f）。BdALS是miR159c的体外真菌靶标，在定殖不同TRV渗透植物的B.dothidea中也以相似的水平表达（图5g）。总之，这些结果表明，M.hupe hensis利用miR159a来防御B.dothidea。
图5。对苹果中miR159a的抑制削弱了植物对斑点球孢菌的抗性。 （a） 逆转录定量聚合酶链式反应测定M.dothidea感染期间miR159a及其前体（miR159a转录物）的水平，分别与MhU6和MhEF-1a标准化。（b） 通过sRNA凝胶印迹测定WT、TRV:00、TRV:aMIR159a、TRV:aMIR159c、TRV:STM159a和TRV:STTM159c的M.hupehensis中miR159a和miR159c的丰度。 （c） 用指定的TRV载体对M.hupehensis渗透的B.dothidea抗性评估。 （d）接种了B.dothidea的不同TRV浸润的M.hupehensis中的病变大小。 （e） 以接种部位为中心的直径为1.5cm的感染组织的病原体定殖系数。 （f） sRNA凝胶印迹法测定miR159a和miR159c在纯化的植物细胞外小泡（EVs）和分离的M.hupehensis真菌原生质体中的积累。 （g） BdSTP和BdALS在B.dothidea中的转录丰度随着BdActin的标准化而定殖在不同TRV渗透的M.hupehensis中。 3.6 利用来源于真菌靶标的dsRNA触发M.hupehensis的HIGS 在基于HIGS的真菌病原体控制策略中，长dsRNA被广泛用作人工前体。我们从BdSTP和BdALS编码序列中选择了大小相似的片段，并使用来自GUS的片段作为对照（分别称为dsSTP、dsALS和dsGUS）。据预测，这些片段可以产生足够的具有沉默诱导活性的siRNA，精确地仅靶向B.dothidea中感兴趣的基因，而不靶向宿主基因。当我们通过TRV系统将dsSTP、dsALS或dsGUS引入菌时，sRNA的存在（通过使用各自的片段作为探针的northern印迹检测）表明外源性dsRNA通过内源性生物合成机制加工成siRNA。当我们用B.dothidea攻击这些TRV渗透的植物时，与用TRV:dsGUS和TRV:00渗透的植物相比，用TRV:DSTP和TRV:dsALS渗透的植物的感染敏感性（由症状决定）和真菌定殖降低（图7a-c）。用TRV:dsALS渗透的植物中的坏死病变比用TRV:DSTP渗透的植物小，但用TRV:dsALS浸润的植物中真菌生物量与用TRV：dsSTP渗透的植物大致相同或更大（图7b，c）。因此，将dsSTP引入M.hupe hensis可能比其毒力更能限制B.dothidea的增殖，而dsALS则影响病原体的增殖和毒力。 我们检测了siRNA在从TRV渗透植物的感染组织中分离的真菌原生质体中的积累，并验证了dsRNA产生的siRNA从宿主向病原体的递送，这进一步得到了在M.hupe hensis EVs中检测到这些分子的支持（图7d）。在B.dothidea定殖TRV:dsSTP植物中，BdSTP转录物的水平低于定殖TRV：00和TRV：dsGUS植物，而B.dothidea定殖TRV/dsALS植物中的BdSTP水平与定殖两个对照的相似。相比之下，在B.dothidea定殖TRV:dsALS植物中，BdALS转录水平低于B.dothidea定殖TRV：dsSTP、TRV:00或TRV:dsGUS植物（图7e）。这些数据表明，将这些siRNA转移到真菌细胞中会特异性地沉默它们来源的dsRNA的来源基因。 总之，这些结果表明，在M.hupehensis中表达的dsSTP和dsALS是B.dothidea跨王国RNAi的有效诱导物；所产生的siRNA被递送到病原体中，并使其真菌焦油、BdSTP或BdALS沉默，成功触发HIGS并增强对宿主的B.dothidea抗性。在将dsSTP或dsALS引入宿主的同时，我们还将这些分子直接导入B.dothidea，并研究这是否诱导了病原体中的基因沉默（图S6）。通过northern印迹检测到的转化菌株中存在两个主要条带，证明了dsRNA在真菌中加工成siRNA；这些条带可能是由B.dothidea的内源性DCL系统产生的。我们观察到在体外培养的表达dsSTP的B.dothidea和dsGUS对照之间在外观上没有差异，尽管在表达dsTP的B.dotsidea菌落中BdSTP转录水平确实降低了。相比之下，表达dsALS的B.dothidea菌落显示出与DALS neo敲除菌株相似的生长缺陷，同时预期BdALS转录水平降低。因此，进口的dsRNA可以在B.dothidea细胞中触发RNAi，这表明它们可以用来抑制真菌的生长和发育，从而保护苹果免受B.dothidia引起的疾病
图7。在苹果中引入来源于真菌基因的dsRNA以触发宿主诱导的菌基因沉默。 （a） TRV渗透M.hupehensis叶片在72 hpi下表达不同dsRNA的照片和数字脱色。 （b）用指示的TRV载体浸润的M.hupehensis感染b.dothidea的病变大小。 （c） 以接种部位为中心的直径为1.5cm的感染组织的病原体定殖系数。 （d） 通过sRNA凝胶印迹法测定纯化的M.hupehensis EVs和从感染组织分离的B.dothidea原生质体中dsRNA产生的siRNA的丰度。 （e） 通过RT-qPCR测定并用BdActin标准化在所指示的TRV渗透的M.hupehensis中定植的B.dothidea中的BdSTP和BdALS的转录水平。 04 结论  许多致病性相关基因被包括在苹果miRNA的预测真菌靶标列表中，包括编码碳水化合物活化酶、植物细胞壁降解酶、次级代谢产物生物合成酶、细胞色素P450酶和分泌肽的基因。 对这些基因的深入研究将增加我们对B.dothidea与苹果相互作用的理解，并有助于利用HIGS作为疾病控制和育种策略，提高苹果和其他木本植物对B.dothiea的抗性。 05 原文获取 原文链接： https://onlinelibrary./doi/10.1111/tpj.16664 PDF获取： https://www./h-nd-327.html |
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