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-----【引语】----- 炎症细胞因子是调节免疫反应、建立有效宿主防御的关键。然而，炎症细胞因子的过量造成炎性疾病对机体的破坏。因此，通过降低细胞因子水平或阻断其生物活性是一种炎性疾病治疗策略。其中，“直接捕获与中和”细胞因子的治疗制剂受到广泛关注。因为它能避开与宿主细胞的相互作用，从而不易诱发免疫原性反应而被清除。本文综述了这些细胞因子中和平台(CNPs, cytokine-neutralizing platforms)的最新研究进展，并讨论了它们在治疗炎症性疾病中的应用。了解这些CNPs的结构-功能关系将有助于设计出有效治疗炎症性疾病的新疗法。-----【内容】----- “单体（monoplex）”细胞因子中和平台，如细胞因子中和抗体(CNAs,cytokine-neutralizingantibodies)，通常是针对某种特定细胞因子进行中和。同时，为解决疾病中细胞因子靶点的多样性问题，也有“多重（multiplex）”细胞因子中和平台的出现：比如含糖胺聚糖生物材料（GAGs-containingbiomaterials）和细胞膜涂层纳米颗粒(cell-membrane-coatednanoparticles)等。
图1：直接捕获与中和炎性细胞因子的主要治疗平台 左：单一中和抗体平台（monoplex neutralization）是以一种特定的细胞因子作为靶标，包括(a)自由抗体（free antibody）和(b)生物材料偶联抗体（biomaterial-conjugatedantibody）。右：复合中和抗体平台（multiplex neutralization）是可以同时中和多种细胞因子的平台，如(c)含糖胺聚糖(GAG)的生物材料和(d)细胞膜包覆的纳米颗粒。 --------------- · --------------- 一、“单体（monoplex）”细胞因子中和平台 ✔转基因小鼠制备嵌合抗体与全人源抗体 嵌合抗体从转基因小鼠杂交瘤细胞中分选，转基因小鼠基因中携带人Ig恒定区域。产生的抗体与没经过改造的鼠源抗体相比，具有增加半衰期以及降低免疫应答的作用。随后，人源化的抗体与人IgG框架融合，并在杂交瘤细胞中表达。最近，包括所有人类序列的全人源抗体被表达有人源IgG转基因小鼠表达出来。 ✔噬菌体库技术制备全人源抗体 全人抗体也使用噬菌体库产生，每种库都表达了用于转染细菌细胞的人源抗体片段。半衰期延长以及免疫应答降低为全人源抗体的应用提供了较大的应用场景。✔抗体样分子用于细胞因子中和 例如，Etanercept的改造方式就是通过将TNFR2免疫粘附因子和人IgG抗体的Fc区域融合，从而同时保证TNF受体区域和TNF-α、TNF-β的中和作用并降低免疫原性。而对于certolizumab pegol, 它采取了PEG介导的化学偶联法来使人源抗原结合Fab片段，从而延长抗体半衰期。✔延长抗体半衰期：在许多能影响循环的因素中，最基本的决定条件是从新生Fc受体（FcRn）入手，它通过影响抗体在溶酶体中的降解来提高其循环效力。因此pH依赖性、等电性能、糖基化都被用作参考分子特性来对新型抗体变异体进行生产与评估，从而保证IgG-FcRn结合能用于提高半衰期。这些方法对于降低剂量，给药频率很有帮助，有利于降低抗细胞因子药物的使用成本。✔提高抗原结合活力：双特异性抗体具有重要影响力。这类抗体能允许抗体靶向特定位点实施细胞因子的定点中和。另外，双靶点的特点有利于发挥不重叠的抗原作用来提高校历。✔抗体产品的改进：主要是进行抗体特性的尽早评估。从这个角度，高通量筛选技术的运用十分重要：主要是噬菌体技术技术与计算机算法的结合，对于推测与优化抗体，使其满足生产可行性，储存稳定性，无脱靶反应性的要求。1.2 生物材料偶联抗体（biomaterial-conjugated antibody） 自由抗体的一大缺陷就是由于剂量与非选择性能造成不良反应。而通过和生物材料偶联，就能对抗体的药物动力学和生物分布进行操控，甚至将抗体带至自由抗体无法到达的位置。生物材料偶联抗体平台包括：聚合物，水凝胶和纳米颗粒（图2，即具体化的图1b）。(a)聚合物，(b)水凝胶和(c)与抗体结合用于细胞因子捕获与中和的纳米颗粒 🔺1.2.1 多聚体偶联抗体（polymer-antibody conjugate） ✔增加整体分子量、降低组织分布速率 例如：抗TNF-α和抗IL-1β抗体，与透明质酸（HA）偶联用于烧伤治疗，而HA的运用增加了抗体在表皮中的分布。在啮齿类动物深度局部烧伤模型中，偶联物能有效减轻急性炎症和减少继发性坏死，更少的炎性细胞的渗入也证实了该假说。 ✔影响抗体与细胞因子结合的亲和程度的因素：多聚体骨架的种类、细胞因子靶标大小。 🔺1.2.2 水凝胶偶联抗体(Hydrogel-antibody conjugate) 这种偶联方式最普遍的应用领域是烧伤，烧伤是由局部炎性因子通过一系列级联反应驱动的损伤进程。使用TNF-α与HA偶联的水凝胶进行研究。 ✔在局部治疗方面具有优势 调节抗体的停留时间可能是调节急性损伤相关炎症反应的一种有效策略：HA水凝胶与抗TNF -α结合显著减少大鼠部分厚度烧伤模型中坏死组织的发展，且能抑制外围与表面中巨噬细胞的浸入，相比自由抗体就只能抑制外围的。通过测试局部抗体浓度，可以发现抗体在表皮停留时间与炎性细胞渗入组织的模式很相关。 ✔体外研究能检测到炎症的减弱并未在体内研究中显现。原因是水凝胶交联密度高，限制了细胞因子扩散到凝胶基质中，因此降低中和效果。需要优化水凝胶交联密度来保证细胞因子朝凝胶基质的最大化内流。 ✔纳米颗粒的固定作用产生较长的药物后效应。例如：为了对关节炎关节中的炎症细胞因子产生中和作用，研究将纳米颗粒（由交联壳聚糖和HA制成）与抗IL-6抗体进行偶联（图3）。偶联机理是：抗体的碳环基团与纳米颗粒表面的胺基特异性反应。与自由抗体相比，纳米颗粒-抗体偶联物对巨噬细胞激活表现出更强的抑制作用，且持续时间更长。纳米颗粒的固定作用减少了抗体药的降解。图3 ：(a)交联壳聚糖和透明质酸(HA)制备的纳米颗粒(NPs)，随后与抗IL-6抗体结合的示意图。(b) NPs中和IL-6和减少滑膜液炎症的功能示意图。（引自2018年美国化学学会） ✔使用磁力纳米颗粒靶向由癫痫引发的组织星型胶质细胞与神经元，有利于进行核磁共振检测。研究使用了急性颞叶癫痫大鼠模型，采用PEG包裹超顺磁性氧化铁纳米颗粒，然后结合抗IL-1β抗体，结果不仅提高了神经元保护作用，还对核磁共振检查做出贡献。--------------- · ---------------二、“多重（mulitiplex）”细胞因子中和平台 与单一细胞因子中和抗体相比，多重细胞因子中和平台没有抗体的参与。2.1 功能化糖胺聚糖（GAGs）相关的水凝胶和纳米颗粒(GAG-containing biomaterial) 胞外基质糖胺聚糖（GAGs，比如硫酸肝素和肝素）能通过静电相互作用力与许多细胞因子结合（图1c）。具体结合方式是细胞因子氨基酸残基的正电荷和GAGs上硫酸基的负电荷相互作用。通过改变GAGs的组成、浓度、以及硫酸化的程度，胞外基质能够调节细胞因子其中的传递，并影响细胞因子的生物活性。从这种动态互作角度出发，GAGs可作为细胞因子清除组分，来构建具有捕获与中和细胞因子功能的生物材料。由于GAGs具有调节复杂结合过程及抑制多种细胞因子的能力，它已成为独特的多元细胞因子中和平台。 图4: GAGs相关水凝胶和纳米颗粒在伤口愈合与中风脑腔治疗中的模型(a)starPEG与不同肝素衍生物交联生成starPEG- GAGs水凝胶支架示意图。水凝胶的网格尺寸(11 nm)和IL-8的旋转半径(2 nm)也被描绘出来。(引自2017年美国科学促进会)（b）一种用于中风后组织修复的可注射水凝胶。由透明质酸和含有不同密度的血管内皮生长因子(VEGF)簇的肝素纳米颗粒组成的水凝胶。中风时脑腔模式图（展示了治疗用水凝胶被直接注射到脑组织腔内，引起星形胶质细胞和小胶质细胞出现。）(引自2018年施普林格自然杂志) 在创面愈合过程中，免疫细胞不受控制地产生细胞因子，导致创面组织遭到破坏，促进免疫细胞进一步浸润，共同形成慢性炎症的恶性循环。通过减少炎症信号，最终促进组织成熟、血管化和表皮细胞再生。某项研究中（图4a），用各种脱硫的肝素衍生物与星形聚乙二醇交联制成水凝胶。这些水凝胶能够在体外和体内中和单核细胞产生的巨噬细胞蛋白-1(MCP-1)α和IL-8。应用于切除伤口时，这种隔离效应导致免疫细胞流入伤口的显著减少。机理研究时发现，水凝胶捕获MCP-1和IL-8的能力随着硫酸盐化程度的降低而降低。强带电细胞因子的结合与水凝胶的整体空间电荷密度相关，而弱带电细胞因子的结合受GAGs硫酸盐化模式的控制。👉举例1：肝素偶联的D-红鞘氨醇纳米颗粒 展现出脂质结构，从而自组装进入稳定的纳米颗粒。与天然肝素相比，使用这种肝素偶联的纳米颗粒，更能降低LPS激发的巨噬细胞中TNF-α，IL-6，IL-beta炎症因子的水平。👉举例2：嵌于HA水凝胶的肝素纳米微凝胶 对于中风后的脑组织修复具有双重价值。在HA水凝胶中加入血管内皮生长因子(VEGF)进行脑内传递，随后在损伤部位直接结合并降低中风时诱导的TNF-α水平(图4b)。研究表明，肝素纳米颗粒可隔离细胞因子，减少星形细胞疤痕的形成，并最终促进中风后的组织修复。该研究纳米颗粒直径在100-200 nm范围内，由肝素与荷电相反的壳寡糖混合而成。👉举例3：层层方法构建的纳米颗粒 首先将聚赖氨酸沉积在带负电荷的聚乳酸芯上，然后将肝素壳沉积在带正电荷的聚乳酸芯上。这些纳米颗粒进一步与C-C趋化因子受体5 (CCR5)片段结合，负责抑制CCR5配体介导的白细胞粘附。在这项研究中，只有肝素和CCR5片段在一个“纳米阱”中结合，在阻断单核细胞与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的粘附方面发挥了最强的抗粘附作用。2.2细胞膜包被的纳米颗粒(Cell-membrane-coated nanoparticles)是一种使用天然细胞膜包裹纳米颗粒的功能驱动平台，对于开发创新治疗型抗细胞因子药物具有重要前景，基本结构见图1d。✔使纳米颗粒能够通过控制类似细胞样功能，实现多面的生物界面、✔可以通过充当靶细胞诱饵，利用细胞膜包被的纳米颗粒通过精确映射疾病病理中细胞因子与受体结合的复杂性和多重性来捕获细胞因子。图5: 巨噬细胞膜与中性粒细胞膜包被的纳米颗粒在败血症与关节炎的治疗模型（a）使用MΦ-NPs中和内毒素和炎性细胞因子的示意图，作为脓毒症管理的两步过程。（引自2017年美国国家科学院杂志）(b) 用于抑制滑膜炎症和改善炎性关节炎关节破坏的中性粒细胞-NPS设计示意图。(引自2018年施普林格自然杂志)🔺2.2.1巨噬细胞膜包被纳米颗粒（MΦ-NPs，Macrophage-membrane-coatednanoparticles） 病理性的“细胞因子风暴”发生在脓毒症中，是细菌感染引起的炎症反应失控的结果，这导致了该疾病的高发病率和高死亡率。体外研究表明（图5a），Mφ-NP可以中和内毒素和炎性因子，要不然会加重败血症级联反应。在大肠杆菌感染的小鼠模型中，具有中和不同革兰氏阴性菌属、种和株的意义。从上到下制备MΦ-NPs可以有效地在目标细胞上复制内毒素结合基序，否则很难识别、纯化和结合。将巨噬细胞膜包裹在纳米颗粒表面可以显著提高膜材料的表面积与体积比，这对于有效中和内毒素至关重要。🔺2.2.2中性粒细胞细胞膜包被纳米颗粒（Neutrophils-NP, neutrophil-membrane-coated nanoparticles）中性粒细胞涂覆的纳米颗粒，用于治疗类风湿关节炎（图5b）。在炎性关节炎的情况下，各种炎症细胞因子水平的升高会加重和维持关节炎症，导致长期的滑膜炎、骨质破坏，最终导致关节功能障碍。类风湿性关节炎的炎症和损伤是由混合免疫细胞涌入滑膜关节间隙介导的，而中性粒细胞在类风湿关节炎进程的启动和延续中起着核心作用。中性粒细胞-NPs已被证明可以中和标志性细胞因子，包括IL-1β和TNF-α。该中和作用可以抑制滑膜炎症，有效抑制软骨细胞活化和凋亡。而且能够模仿软骨细胞与中性粒细胞之间的天然粘附，从而提高软骨基质的渗入率，利于靶向作用。在使用胶原诱导的关节炎小鼠模型中，有利于改善关节损伤，抑制整体关节炎严重程度。本文有关开发抗细胞因子中和平台的最新进展，介绍了用于提高抗细胞因子治疗效率的生物材料，并强调了三种将生物材料朝功能化与安全性细胞因子中和平台改造的方法（优缺点分析见表2），由此建立了包括聚合物偶联子、水凝胶和纳米颗粒在内的抗细胞因子平台。
表2 主要抗细胞因子平台的优缺点分析 治疗各种炎症性疾病的药物发现受到炎症通路本身复杂性的挑战，导致尽管一直多个靶标，也不足以减少炎症反应。同时，由于炎症信号通路的整合或代偿通路，对一种炎症通路的抑制会激活另一种炎症反应。而有些炎症反应对于机体有积极意义，抗炎药也需要适度使用。 通过按特定靶标（动物毒液、细菌毒素、抑制肿瘤发生的细胞因子）对合成聚合物纳米颗粒改造，可以构建抗体偶联物的替代品；核酸适配子也与生物材料整合，作为细胞因子抗体的替代品。✨总之，通过将生物材料与细胞因子的捕获与中和功能结合，将成为一种治疗炎症疾病新疗法。https://www./doi/10.31635/ccschem.020.202000165 文章出处：Qiangzhe Zhang, Hua Gong, Weiwei Gao & Liangfang Zhang. RecentProgress in Capturing and Neutralizing Inflammatory Cytokines[J]. 2020, CCSChem. 2, 376–389 指导教师：王战辉 —————END————— 抗体故事分享基于抗体的分析方法研究进展，欢迎投稿！ 长按下图识别图中二维码，轻松关注！
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