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结果： 生物信息学分析数据显示，CLEC2D mRNA水平在ccRCC组织中上调，并与预后相关。为了评估CLEC2D在ccRCC组织中的表达情况，作者首先调查了TCGA数据库中人类ccRCC和正常组织中CLEC2D的mRNA水平。总共包括523个ccRCC组织和100个正常组织。作者注意到ccRCC组织中CLEC2D的mRNA水平较高（图1A，p < 0.05）。此外，作者通过TCGA数据库评估了CLEC2D mRNA水平与ccRCC患者预后之间的相关性。进行Kaplan-Meier（KM）生存分析以评估CLEC2D表达是否影响ccRCC患者的预后。有趣的是，作者发现CLEC2D表达与ccRCC患者的总体生存率（OS）相关（p = 0.0041）（图1B）。此外，另一个数据库（TCGA，Firehose Legacy cohort，448个样本）也显示了总体生存率的显著差异（p = 4.48e-06）（图1C）。此外，作者通过TCGA数据库发现CLEC2D的高表达与ccRCC患者的肿瘤分级和分期有关（图1D）。因此，作者认为CLEC2D在人类ccRCC组织中上调，并与预后相关。
鉴于CLEC2D在肿瘤中的重要作用，作者在The Human Protein Atlas（Atlas，https://www./）中检查了其表达水平，并发现CLEC2D的高表达与肾癌患者的不良生存率相关（图S1A）。此外，Atlas的免疫组化数据库显示CLEC2D在结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和肝癌中表达较高（图S1B）。为了进一步研究CLEC2D在ccRCC组织中的表达情况，作者进行了免疫组化实验。在作者医院的患者中，检测了70例肿瘤组织和相应的正常组织中的ccRCC表达情况。此外，比较了肿瘤组织和正常组织中CLEC2D的差异表达。重要的是，作者发现ccRCC组织中CLEC2D的表达明显高于正常组织（图2A和B）。因此，CLEC2D蛋白在人类ccRCC组织中上调表达。
作者分析了CLEC2D表达与ccRCC患者的临床特征之间的相关性。评估了患者的年龄、性别、肿瘤分级和肿瘤大小。根据CLEC2D的表达将70名患者分为低表达组和高表达组。作者注意到36名患者表现出低CLEC2D表达（51.4%，表1），而34名患者（48.6%）表现出高CLEC2D表达。根据结果，在CLEC2D低表达组和高表达组之间的临床特征，包括患者年龄（p = 0.073）、性别（p = 0.241）和肿瘤分级（p = 0.084），没有发现显著相关性（表1）。重要的是，作者注意到CLEC2D表达与ccRCC患者的肿瘤大小（p = 0.019）明显相关（表1）。因此，作者认为CLEC2D表达与ccRCC患者的肿瘤大小有关。为了进一步研究CLEC2D在ccRCC中的潜在生物功能和机制，通过cBioPortal数据集在Firehose Legacy队列和PanCancer Atlas队列中进行了基因共表达分析。如图3A所示，两个队列的前50个基因中合并了36个基因，包括Firehose Legacy队列和PanCancer Atlas队列，表明这些基因可能与CLEC2D有相关性（表2，表3）。具体而言，CLEC2D的表达与影响免疫浸润进展的PVRIG、MIR155HG、TRAF5之间存在显著关联，如图3B所示。36个共表达基因的GO和KEGG富集分析显示，CLEC2D可能对ccRCC中的免疫浸润起作用，影响T细胞激活、免疫缺陷、Th1和Th2细胞分化以及NF-κB通路（图3C）。值得注意的是，这些细胞过程和通路与免疫浸润的进展有关。总之，CLEC2D共表达基因富集分析证实了CLEC2D对ccRCC中的免疫浸润的影响。
上述数据表明CLEC2D可能在ccRCC中调节肿瘤免疫。接下来，通过TIMER2.0分析了肿瘤免疫浸润与CLEC2D表达水平之间的相关性。结果显示，CLEC2D与ccRCC的免疫亚型密切相关（图4A）。然后，作者进一步研究了CLEC2D表达与肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）和免疫抑制剂之间的相关性。如图4B和C所示，显示了与TK1表达的Spearman相关性检验rho大于0.4的前三个TILs和免疫抑制剂。
在ccRCC细胞系中，CLEC2D被shRNA质粒耗竭。提取了786-O和Caki-2细胞系实验组（CLEC2D shRNA转染组，shCLEC2D）和对照组（对照shRNA转染组，shControl）的总mRNA。qPCR实验显示实验组中CLEC2D的mRNA表达低于对照组（p < 0.01）（图5A）。通过免疫印迹实验，提取了对照组或CLEC2D缺失的786-O和Caki-2细胞中CLEC2D的蛋白水平，并且实验组（shCLEC2D）中CLEC2D的蛋白表达低于对照组（p < 0.01）（图5B）。
CLEC2D的敲除抑制了786-O和Caki-2细胞的增殖。786-O和Caki-2细胞分别转染了CLEC2D shRNA和空载体。经过9天，对照组克隆细胞形成的细胞数量明显高于CLEC2D耗竭组（p < 0.05）。786-O和Caki-2细胞均显示出一致的结果（图5C）。CCK-8增殖实验显示，与对照组相比，CLEC2D耗竭后786-O和Caki-2细胞的增殖能力降低（p < 0.01）（图5D）。抑制CLEC2D的消耗阻止了小鼠肿瘤的生长和免疫浸润。为了研究CLEC2D对肿瘤生长的影响，将3×10 6 shCLEC2D细胞或shControl细胞植入BALB/C裸鼠的左踝部。29天后，解剖裸鼠以观察肿瘤形成情况。结果显示，CLEC2D耗竭组的肿瘤重量显著低于对照组（p < 0.05），表明CLEC2D的下调抑制了体内肿瘤生长（图6A）。然后，进行免疫组织化学（IHC）实验以检测两组肿瘤组织中CLEC2D的表达。值得注意的是，实验组（shCLEC2D）中CLEC2D的表达低于对照组（p < 0.01）（图6B）。为了进一步确认对免疫浸润的影响，作者从肿瘤组织中分离出CD8 + T细胞，并发现CLEC2D耗竭组中CD8 + T细胞水平降低（图6C）。作者进一步检测了分离的CD8 + T细胞中的IFN-γ，确认CLEC2D耗竭组中CD8 + T细胞的IFN-γ水平降低（图6D）。因此，CLEC2D耗竭抑制了肿瘤的免疫浸润。
总结 总之，作者确认 CLEC2D 在人类 ccRCC 组织中明显高表达，并且 CLEC2D 的表达与 ccRCC 患者的预后相关。此外，作者发现 CLEC2D 的表达与 ccRCC 患者的肿瘤大小相关。综上所述，作者发现 CLEC2D 高表达，并认为 CLEC2D 可以作为 ccRCC 治疗的有希望的靶点。
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