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CD40激动剂由于能够增强树突状细胞(DC)的激活和伴随的肿瘤特异性T细胞启动，使得该靶点在癌症免疫治疗(CIT)中具有很大前景。然而CD40的广泛表达导致的剂量限制性副反应，如细胞因子释放综合征(CRS)和肝毒性等严重的限制了CD40抗体的疗效。因此如何设计CD40激动性抗体，使其在保持治疗的效果的同时降低副作用是目前研究重点。 近日来自于以色列的研究学者利用双特异抗体，将靶向CD40的抗体和靶向DC1细胞特异性抗原的抗体组合，使得双抗上的CD40特异性的激活DC1细胞，从而降低了CD40单克隆抗体靶向其它细胞导致的免疫毒性。个人认为，该方案也为其它激动型抗体的开发提供了另外一种思路，接下来我们详细了解一些该双抗的开发过程和思路。
cDC1介导CD40单抗发挥药效，但不产生毒性 为了研究DC1细胞在CD40抗体中发挥作用以及是否产生CD40用药的相关毒性，研究者构建了Batf3缺陷小鼠（Batf3在1型DC细胞的发育中起重要作用），利用OVA抗原免疫和CD40联用时，CD8 细胞的数量显著增加（下图a-b），而且Batf3缺陷小鼠中，CD40无法抑制肿瘤细胞的生长（下图c），这表明DC1型细胞以及CD40对于激起CD8T细胞具有重要作用,并且在肿瘤抑制中发挥关键最用。
在毒性方面，CD40单抗治疗Batf3及Cd11c敲除的小鼠同样会产生肝脏毒性（下图a），这说明DC细胞与CD40抗体治疗的相关毒性无关。而在hCD40/FcγRs人源化小鼠模型中，2141-V11激动型CD40单抗可以造成和临床中类似的肝脏毒性（下图b）。利用Clodronate liposomes（氯膦酸二钠脂质体）清除巨噬细胞和吞噬细胞后，相关的肝脏毒性基本消失（下图b），这表明巨噬细胞和吞噬细胞在CD40介导的肝脏毒性方面发挥重要作用，其可能是通过Kupffer细胞FcγRIIB介导的抗体交联在肝脏中激活血小板或者是CD40相关通路直接激活巨噬细胞发挥作用。 利用抗体CD42b抗体清除血小板后，CD40治疗因其的肝脏毒性也大幅度减弱（下图c），因此血小板在肝脏毒性中发挥作用（通过巨噬细胞和Kupffer产生血小板凝聚）。而在CD40治疗后血小板减少症方面，系统的清除巨噬细胞可以得到缓解（下图d）。因此，CD40治疗的肝脏毒性和血小板减少症主要与巨噬细胞和血小板相关。 CRS反应方面，CD40单抗治疗后会引起脾脏，淋巴结等处的单核细胞的IL-6分泌增加（下图e），因此单核细胞可能是CD40激动型抗体治疗后引起CRS反应的主要效应细胞。
特异性靶向DC细胞的CD40双抗 上述的研究已经表明，CD40通过CD细胞发挥抗肿瘤作用，且CD细胞不会产生相应的毒性及副作用，因此研究者结合CD40激动型抗体构建了靶向DC细胞的特异性标志物DEC-205或者CD11c的双特异抗体（下图a），并对抗体的Fc改造增强其与FcγRs的结合（增强抗体的交联）。体外研究表明双特异抗体对CD40和相应的靶点都具有较好的结合能力（下图b）。而在人源化小鼠体内，抗体注射后对相应的免疫细胞分析发现，双抗更多富集于CD11c高表达的免疫细胞，如DC等（下图c和d）
双抗对DC细胞的激活 CD40单克隆抗体激动剂激活CD40-CD40L的通路主要是通过抗体两个Fab及FcγR形成交联促进CD40形成多聚体。本文中的双抗仅有一个Fab靶向CD40，但是进行了FcγR结合增强的相关突变，但是研究表明CD40/CD11c 和 CD40/DEC-205两种抗体都能有效的激活DC细胞，并且可以诱导激活T细胞（下图a-b）,但是在人源化小鼠体内CD40/CD11c具有更好的效果，这可能是抗体中靶向DC细胞的Fab不同造成的。 对脾脏中的B细胞和DC细胞分析发现，与CD40单抗不同的是，双抗更多的激活DC细胞（下图C），并且在人源化小鼠体内，双抗同样是更多的激活DC细胞（下图d）。
双抗激活依赖于FcγR结合后的交联 为了验证双抗是否也需要像CD40激动型单抗一样，需要FcγR介导的交联，研究者构建了对FcγR不同亲和力的双抗，WT hIgG1（野生型）,IgG1-N297A (N297去糖基化消除对FcγR的结合) 和hIgG1-V11（FcγR结合增强型抗体），结果显示，FcγR结合增强型双抗对激活DC细胞具有最强的效果（下图）
双抗可以有效的提高CD40治疗窗口 在人源化小鼠体内，双抗不仅能更好的激活CD8T细胞，而且在肝脏损伤方面具有更低的副作用，同时具有更低的CRS相关因子释放水平（下图a-f）。在抑制肿瘤生长方面，双抗比CD40具有更好的效果，且与PD-1抗体联合使用时，其治疗效果更加优异（下图g-h）。
CD40/CD11c双抗可以激活肿瘤微环境中的DC和T细胞 在MC38肿瘤模型中，双抗治疗可以显著的增加肿瘤中DC细胞的活性（下图a），而在dLN（淋巴耗竭）的模型中，双抗治疗后，肿瘤中DC1和DC2的数量和活性都显著增加（下图b-c）。 对治疗后的小鼠进行转录组分析，结果显示淋巴结中的CD8T记忆细胞，天然的CD8T细胞（naïve）以及天然的和效应CD4T细胞的数量增加，而CD4 Treg和无功能的CD8T细胞降低（下图d-e），并且与之相关的基因表达也显著降低（下图f）。
靶向CLEC9A的双抗进一步优化双抗的治疗窗口 CD11c除了大量在DC细胞上表达外，还在活化的巨噬细胞，非典型单核细胞中少量表达，在人体中其还在一些组织特异性巨噬细胞和单核细胞中表达，这在一定程度上限制双抗的治疗窗口。因此研究者构建了靶向CLEC9A的CD40双抗。CLEC9A一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，其在其它免疫细胞上很少表达（下图a）。CLEC9A/CD40双抗不仅能激活CD8T细胞而且同样具有更低的肝毒性（下图b-f）。在肿瘤的抑制方面，CLEC9A/CD40同样具有较好的效果（下图h）。
总结 CD40激动型抗体的剂量限制性毒性在一定程度上限制了抗体的治疗效果，目前很多研究探索在瘤内注射抗体以减小相关毒副作用。本文的研究者研究进一步表明了CD40抗体的毒性主要与巨噬细胞，血小板等相关。而DC细胞不仅与相关毒性无关，而且是CD40发挥药效的主要媒介细胞。因此研究者构建了能特异性靶向DC细胞的双特异抗体，利用双特异抗体仅激活DC细胞，从而减小相关副作用。临床前的研究表明，特异性靶向DC细胞的CD40/CD11c 和 CD40/DEC-205双抗不仅能够减小副反应，增加治疗窗口，而且能够有效的激活肿瘤微环境中的DC细胞。在此基础上，研究者了更加安全的CLEC9A/CD40的双抗，其同样可以激活DC细胞抑制肿瘤细胞的生长。 激动型抗体在临床治疗中具有一定的疗效，但是其带来的副作用严重的影响了这些药物药效的发挥，而本研究给激动型抗体的开发提供了另外一个方向，即利用双特异抗体，特异性的靶向激活特定的免疫细胞，从而在避免毒副作用的同时，释放激动型抗体的疗效。 参考文献： Ran Salomon , Hagar Rotem, Yonatan Katzenelenbogen et al. Bispecific antibodies increase the therapeutic window of CD40 agonists through selective dendritic cell targeting.Nat ure Cancer 2022 |
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