【原】5+单基因泛癌+免疫+实验，可操作性强！

智汇基因 2024-04-20 发布于广东

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导语

结果：

EMC6在多种癌症中的高表达与患者预后密切相关

根据TIMER数据库中33种癌症中EMC6的表达情况，作者发现除了肾脏发细胞瘤（KICH）和肾透明细胞癌（KIRC）的表达水平明显降低外，大多数癌症中EMC6的表达都比相应的正常组织要高得多（图1A）。此外，EMC6的表达水平在膀胱尿道癌（BLCA）、乳腺浸润性癌（BRCA）、食管癌（ESCA）和肺腺癌（LUAD）中尤为明显升高。TMB的值显示了肿瘤细胞的基因突变情况。基因突变较多的肿瘤细胞更能刺激免疫反应。因此，TMB的值也可以在某种程度上显示患者的预后情况。对33种癌症的TMB分析结果显示，EMC6的表达与胃腺癌（STAD）、肉瘤（SARC）、子宫体内膜癌（UCEC）和LUAD的基因突变密切相关（图1B）。基因表达变异对患者预后的影响是衡量该基因是否是这种癌症的重要生物标志物的关键标准。单因素Cox回归分析的森林图显示，EMC6的表达改变对包括宫颈鳞状细胞癌和子宫内膜腺癌（CESC）、食管鳞状细胞癌（ESCA）、脑低级别胶质瘤（LGG）等在内的七种癌症患者的预后有显著影响（图1C）。值得注意的是，EMC6的表达对LUAD患者的预后影响最为显著（p < 0.001）。接下来，在总体生存（OS）分析中，作者发现与EMC6表达较低的患者相比，EMC6表达较高的患者在肾上腺皮质癌（ACC，p = 0.016）、CESC（p = 0.002）、LGG（p = 0.031）、LUAD（p = 0.039）、肺鳞状细胞癌（LUSC，p = 0.047）和胰腺腺癌（PAAD，p = 0.049）中的预后较差（图1D）。所有这些无显著结果可以在附加文件中找到。

EMC6参与了许多癌症的恶性进展

疾病特异性生存（DSS）是一个指标，可以更准确地评估疾病的临床预后。对33种癌症的DSS进行单因素Cox回归分析清楚地表明，EMC6的表达与多种癌症的DSS密切相关，如BLCA（p = 0.032）、CESC（p = 0.01）、LGG（p = 0.018）、PAAD（p = 0.04）等（图2A）。预期地，EMC6的表达仍然对LUAD的DSS产生最强的影响（p = 0.004）。Kaplan-Meier（KM）分析结果显示，有六种癌症的DSS与EMC6的表达密切相关（图2B）。LUAD（p = 0.023）也包括在这六种癌症中。患者的临床分期显示了患者的临床病理特征，意味着肿瘤组织的恶性进展和患者的预后。因此，作者在33种癌症中搜索了GEPIA2数据库，以了解不同病理分期下EMC6的表达情况。进一步发现，在KICH（p = 0.0206）、LUAD（p = 0.0205）和皮肤黑色素瘤（SKCM，p = 0.0451）（图2C）。相反，EMC6的表达在肾脏肾乳头细胞癌（KIRP，p = 0.0473）和子宫癌肉瘤（UCS，p = 0.0169）的肿瘤进展过程中逐渐减少（图2C）。为了更好地验证作者的结果，作者使用了来自HPA数据库的生存分析数据（图3）和DNA甲基化状态（图4）来确认作者的发现。

EMC6 的表达与肿瘤免疫之间的关系

众所周知，免疫反应是作者身体抵抗肿瘤细胞发展的最重要机制。为了探索 EMC6 是否参与了 33 种癌症中的肿瘤免疫，作者在 TCGA 数据上对 EMC6 与一系列免疫相关基因进行了共表达分析。共表达分析的热图显示，EMC6 的表达与免疫激活基因（图 5A）、趋化因子（图 5B）、趋化因子受体（图 5C）和主要组织相容性复合物（MHC）（图 5D）在几乎所有类型的癌症中密切相关，除了 ACC、淋巴样肿瘤弥漫性大 B 细胞淋巴瘤（DLBC）、间皮瘤（MESO）和子宫颈肉瘤（UCS）。有趣的是，作者发现 EMC6 的表达与肾上腺皮质肿瘤（KICH）和葡萄膜黑色素瘤（UVM）等癌症中的免疫反应显著正相关，与胆管癌（CHOL）和肺腺癌（LUAD）等癌症中的免疫反应显著负相关（图 5）。

EMC6 在 LUAD 中的关键作用

通过早期的分析，作者发现EMC6参与了各种癌症的肿瘤免疫反应；特别是在LUAD中，EMC6的表达与各种免疫相关基因呈显著的负相关，这表明EMC6很可能参与了LUAD的免疫逃逸过程。因此，作者首先利用多个GEO数据集（GSE19188、GSE44077、GSE31201和jacob-00182-HLM）进行差异表达分析（图6A和6B）和生存分析（图6C和6D），以确认EMC6在LUAD中的关键作用。然后，作者构建了LUAD中EMC6的微小RNA（miRNA）调控网络（图6E），并观察了CCLE数据库中各种LUAD细胞系中EMC6的表达（图6F）。接下来，作者通过CIBERSORT算法重新评估了EMC6与LUAD肿瘤免疫的关系。这项分析的结果显示，EMC6与LUAD中的肥大细胞（p = 3.9e-08）、CD4 T细胞（P = 1e-07）、免疫评分（p = 4.8e-05）和基质评分（p = 1.9e-07）呈显著的负相关（图7A）。为了验证作者的分析，作者使用siRNA构建了EMC6敲低的LUAD细胞系A549，并使用qPCR验证了EMC6敲低的效率（图7B）。然后，作者使用构建的EMC6敲低A549细胞系进行了一系列的细胞功能实验。首先，CCK-8实验的结果显示，EMC6蛋白水平的降低极大地减弱了A549的增殖能力（图7C）。其次，转移实验的结果显示，在相同时间内，EMC6敲低的A549细胞的迁移和侵袭能力明显较正常A549细胞少（图7D）。最后，创伤愈合实验的结果再次证明，EMC6的存在对A549的迁移能力起着重要作用（图7E）。既然作者已经探索了EMC6对A549细胞的影响，作者想要探索EMC6在LUAD中的机制。众所周知，EMC6已被证明是自噬的关键基因，所以作者想知道EMC6是否也参与了LUAD中的铁死和铜死过程。有趣的是，共表达分析显示EMC6与与铁死亡和铜死亡相关的基因确实密切相关（图7F）。为了使这一发现更具临床应用性，作者使用连接图谱（CMap）预测了与EMC6相关的小分子化合物及其相应的靶基因（表S1）。根据这些结果，作者发现“米托酮”可能能够调节肺癌和糖尿病之间的关联。然后，作者对LUAD中与EMC6相关的基因进行功能富集分析。主要富集的Kyoto基因和基因组百科全书（KEGG）通路包括JAK-STAT信号通路、细胞粘附分子（CAMs）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路和核糖体（图7G）。富集的分子功能（MFs）包括核糖体的结构成分和细胞因子受体活性（图7G）。此外，EMC6的生物过程（BPs）包括前体代谢物和能量的生成以及GTP酶活性的调节（图7G）。富集的细胞组分（CCs）包括线粒体内膜、线粒体基质和受体复合物（图7G）。此外，TIMER数据库的结果表明，EMC6的表达水平对LUAD中多种免疫细胞的浸润有显著影响（图7H）。然而，细胞学实验仅仅模拟体外细胞的生物过程，而体内实验能更好地展示真实过程。因此，作者使用C57小鼠构建了一个皮下激素肿瘤模型（图8A）。结果显示，减少LUAD细胞中EMC6的表达可以显著降低肿瘤的生长速率（图8B），并且可以显著增加肿瘤组织中免疫细胞（CD4 T细胞、CD8 T细胞和巨噬细胞）的浸润（图8C和8D）。最后，为了提高本研究的临床意义，作者观察了HPA数据库中LUAD组织和正常肺组织中EMC6的免疫组化结果。结果显示，LUAD组织中EMC6的表达显著高于正常肺组织（图9）。