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结果： 为了揭示肝细胞癌（HCC）中的肿瘤异质性，作者通过分析从GEO数据库GSE149614获得的10个HCC组织的单细胞RNA测序数据，探索了HCC中的恶性肝细胞簇。总共分析了14,779个单细胞以获得这些单细胞RNA测序数据。亚簇分析鉴定出9个具有不同标记基因和生物功能的恶性肝细胞簇（图1A和B）。在GO富集分析和KEGG分析中，前10个GO和KEGG通路显示C1_Hepatocyte-CRP、C2_Hepatocyte-TFDP3、C4_Hepatocyte-SPP1、C5_Hepatocyte-HHIPL2、C7_Hepatocyte-GTSE1和C9_Hepatocyte-CT45A10主要参与了致癌基因的激活。C8_Hepatocyte-SLCO1B3主要参与调节代谢过程。C3_Hepatocyte-SERF2和C6_Hepatocyte-IL13RA2主要通过调节JAK/STAT信号通路和原发性免疫缺陷来调节免疫微环境（图1C和D）。这些恶性肝细胞簇的前三个标记基因分别是：CRP、FGF19和SLC25A47（C1_Hepatocyte-CRP）；TFDP3、XX-CR54。1、GREM2（C2_肝细胞-TFDP3）；SERF2、TMSB4X、RPS19（C3_肝细胞-SERF2）；SPP1、ADH4、ALDH3A1（C4_肝细胞-SPP1）；HHIPL2、SLC22A11、NTM（C5_肝细胞-HHIPL2）；IL13RA2、C11orf53、C6orf141（C6_肝细胞-IL13RA2）；GTSE1、DLGAP5、BUB1（C7_肝细胞-GTSE1）；SLCO1B3、TAT-AS1、LINC01554（C8_肝细胞-SLCO1B3）；CT45A10、ADAD1、MSC-AS1（C9_肝细胞-CT45A10）（图2A）。总之，作者鉴定出了9个具有不同标记基因和生物功能的恶性肝细胞簇，揭示了它们与免疫微环境的关系。
在单细胞测序数据中分析了10例肝细胞癌（HCC）患者，其中6例患者处于早期/中期阶段且没有HCC转移。因此，将他们分为非转移组。具体而言，其中3例患者处于TNM分期I期，1例患者处于TNM分期II期，另外2例患者处于TNM分期IIIA期。另外4例患者处于晚期并有HCC转移，将他们分为转移组。具体而言，其中2例患者处于TNM分期IIIB期，另外2例患者处于TNM分期IV期。在C3_Hepatocyte-SERF2、C6_Hepatocyte-IL13RA2和C9_Hepatocyte-CT45A10中，转移组的基因表达高于非转移组（附表1）。而在C1_Hepatocyte-CRP、C5_Hepatocyte-HHIPL2和C8_Hepatocyte-SLCO1B3中，转移组的基因表达低于非转移组（附表1）。在9个恶性肝细胞簇中，鉴定出465个差异表达基因（DEGs），这些基因在转移组和非转移组之间存在差异（附表2）。为了探索这些基因的生物学功能，作者进一步对它们进行了GO富集分析和KEGG分析。在GO富集分析的生物过程（BP）中，这些DEGs主要参与免疫系统过程和代谢过程（图2B和C）。根据KEGG分析，这些基因主要涉及癌症和免疫系统途径（图2D和E）。因此，作者认为免疫微环境是调控HCC转移的一个重要途径。TPI1被验证为C6肝细胞-IL13RA2和HCC转移的关键基因为了验证与转移相关的差异表达基因（DEGs），作者进行了进一步的生物信息学和免疫组化分析。基于TCGA-LIHC数据库，进行了单变量Cox回归分析，以确定与患者预后相关的转移相关基因。结果显示，共有79个与HCC患者生存期（OS）显著相关的转移相关基因（附表3，P < 0.05）。进一步进行LOSSO回归分析，构建了一个包含这些基因的预后模型（图3A-F，附表4）。最终选择了四个关键的转移相关基因（ITM2A，HSP90AA1，RSU1和TPI1）（系数>0.1）。作者发现这四个基因都是C6_Hepatocyte-IL13RA2的标记基因，并初步验证了它们在有和无转移证据的HCC组织中的表达情况（附图1）。结果显示，只有TPI1的表达与HCC的预后和转移有关。因此，进一步在TCGA-LIHC数据库中分析了TPI1的mRNA水平和预后结果。根据结果显示，根据患者年龄、性别、病理分期、病理T分期、组织学分级和血管侵犯，HCC组织中TPI1的表达明显高于正常对照组（图4A）。与之前的结果一致，TPI1在病理T分期较晚的患者中表达显著增高（图4A）。预后结果还表明，TPI1表达较高的患者整体生存率较差（P < 0.001），疾病特异性生存率也较差（P = 0.010）（图4B）。结果表明，C6_Hepatocyte-IL13RA2中的关键基因TPI1与HCC的预后和转移显著相关。
根据先前的结果，TPI1是C6_Hepatocyte-IL13RA2的标记基因之一，主要参与调节HCC的免疫微环境（图1C和D）。免疫微环境也是与转移相关基因富集的主要途径（图2B-E）。因此，基于TCGA-LIHC数据库，分析了TPI1表达与免疫细胞浸润（B细胞、Th2细胞、CD8 T细胞、树突状细胞（DCs）、中性粒细胞和巨噬细胞）之间的关系。如图4C所示，HCC中TPI1表达水平与浸润的CD8 T细胞（R = -0.199，P < 0.001）、DCs（R = -0.172，P < 0.001）和B细胞（R = -0.139，P = 0.007）呈负相关，而与浸润的Th2细胞（R = 0.356，P < 0.001）呈正相关。此外，TPI1的表达与肿瘤免疫估计资源（TIMER）数据库中浸润的调节性T细胞（Tregs）和髓源性抑制细胞（MDSCs）水平呈正相关（R = 0.265，P < 0.001；R = 0.460，P < 0.001；图4D）。编程细胞死亡蛋白1（PD-1）和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）是两个突出的免疫检查点，在包括HCC在内的多种恶性肿瘤中被发现是最可靠的抑制抗肿瘤免疫反应的靶点。它们在肿瘤微环境中对免疫反应的调节起着关键作用。为了初步探索TPI1对免疫微环境影响的潜在机制，评估了TPI1表达与PDCD1和CTLA4表达之间的关系在TIMER数据库中。在HCC中，TPI1的表达与PDCD1和CTLA4的表达呈显著正相关（R= 0.224，P < 0.001；R= 0.204，P < 0.001；图4E）。这些结果初步表明TPI1可能参与调节HCC免疫微环境，并与PDCD1和CTLA4的表达呈显著正相关。TPI1表达与CD8 T细胞在HCC中的浸润的关联为了验证TPI1在HCC中的表达水平和预后价值，作者通过免疫组化和预后分析对46个HCC标本进行了分析（图5A）。结果显示，TPI1在有转移证据的HCC患者中的表达水平比没有HCC转移的患者要高得多（图5B）。此外，TPI1表达水平较高的患者的总体生存率较差（P = 0.011，图5C）。作者还评估了这些HCC标本（包括肿瘤、肿瘤邻近组织和正常组织）中CD8的表达情况（图5D）。有趣的是，在肿瘤邻近组织中，CD8的表达与TPI1的表达呈负相关（P < 0.01，图5E），但在肿瘤或正常组织样本中没有呈现相关性（P > 0.05，图5E）。此外，没有HCC转移的患者的肿瘤邻近组织中CD8的表达要高于有转移证据的患者（P < 0.05，图5E）。作者还在作者的队列中进行了免疫荧光染色。结果还显示，TPI1在肿瘤组织中与CD8的表达呈负相关（图5F）。总之，这些发现验证了TPI1表达与HCC转移和不利预后之间的正相关性，同时表明与CD8 T细胞浸润的负相关性。
总之，TPI1 + 恶性肝细胞簇与 CD8 + T 细胞浸润的抑制以及 HCC 转移相关联，为 HCC 免疫治疗的潜在生物标志物提供了新的见解。
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