    该文描述了一种新的方法，用于从二维（2D）多能干细胞（PSC）培养直接生成三维（3D）人类大脑类器官（hCOs）。这种方法避免了传统方法中的解离和聚集步骤，简单且可重复的方法能高效产生神经上皮组织，为大规模获得脑类器官结构提供了可能。生成的脑类器官结构包含多种脑细胞类型，为研究特定细胞类型相关病理提供了良好模型。这一创新方法有望改善和克服当前脑类器官结构研究的限制，为许多研究人员提供便利。  通过从神经诱导步骤开始就对2D培养进行双重SMAD抑制和CHIR99021处理，所生成的hCOs发育良好，具有增殖性的脑室区（VZs），由神经前体和径向胶质（RG）组成，它们分化为成熟的神经元和胶质细胞。此外，hCOs还包含其他细胞类型，如少突胶质细胞前体、星形胶质细胞、类似于小胶质细胞和内皮细胞。这种新方法可能会帮助克服类器官生物技术领域的一些现有限制，使其更容易在任何实验室环境中执行。 人类多能干细胞（hPSCs）培养：人类胚胎干细胞（hESCs，AND-2细胞系）来源于西班牙的“Granada母细胞库”（ISCIII），并经过验证无支原体污染。这些细胞在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上进行培养，而MEFs先通过丝裂霉素C处理进行有丝分裂失活。hESCs在MEFs上维持，并使用特定培养基，其中包含必要的营养成分和补充剂，如成纤维细胞生长因子2（FGF2）和ROCK抑制剂Y-27632。每隔一天更换新鲜培养基，直到集落达到中小尺寸。整个培养过程在37℃和5% CO2的条件下进行。  图1 通过直接诱导hESC集落中神经上皮生成hCOs。（a）hCOs生成的主要阶段示意图，以及不同阶段所用培养基和因子的时间线。hCOs不同发育阶段的代表性明场图像：增殖中的hESC集落；神经诱导阶段，从板上脱落的3D结构；神经诱导中转移到新的低粘附板（悬浮）的3D神经上皮样结构；分化的hCOs；成熟（维持培养基）的hCOs。比例尺=100µm。（b）hESCs神经诱导过程中形态变化的代表性明场图像：增殖中的hESCs；神经诱导中的hESC集落开始分化，产生组织重塑（白色箭头）；从集落生成3D结构并开始从板上脱落；具有神经上皮样边界的3D结构（悬浮）（白色方框）。比例尺=100µm。（c）神经上皮结构的代表性图像，用Ki67、Sox2、Vimentin和Nestin（绿色）进行免疫染色。细胞核用Höechst染成蓝色。比例尺=50µm。（D）神经诱导阶段MKI67、SOX2、VIM和NES基因表达的绝对定量RT-qPCR。数据表示平均值±标准差（每个实验n=4；结果在两次独立实验中得到证实）。白色虚线标记结构以显示神经上皮。 AA：抗坏血酸；hCOs：人脑类器官组织；hESC：人胚胎干细胞；Hoe：Höechst；hPSC：人多能干细胞；MEFs：小鼠胚胎成纤维细胞；VIM：Vimentin；NES：Nestin。  1、通过直接诱导hESC集落中的神经上皮细胞生成hCOs 研究人员通过策略性地结合双重SMAD抑制和适当剂量的CHIR99021（一种GSK3抑制剂/Wnt激活剂），成功地从2D到3D培养模型直接生成了神经上皮组织。这种方法生成的hCOs具有增殖性心室区（VZs），其中包含神经前体细胞和径向胶质（RG）细胞，这些细胞分化为成熟的神经元和胶质细胞。此外，使用这种方法生成的hCOs还展示了多种细胞类型，包括少突胶质细胞前体、星形胶质细胞、类似小胶质细胞和内皮样细胞。总体而言，这项创新技术提供了一种简化且可重复的方法来生成具有高水平细胞多样性的hCOs，为研究人类大脑发育和相关病理提供了有价值的工具。  2、hCO形态和心室区（VZ）随时间的演变 研究描述了人类大脑类器官（hCO）形态和心室区（VZs）随时间演化的过程。通过直接诱导hESC集落生成的神经上皮样聚集体在分化培养基中培养，然后转至维持培养基中培养不同时间以观察其发展。明场图像显示，分化的hCOs最初具有球形形态，边缘平滑，透光区域，随着成熟而变得更为致密。类器官随时间逐渐增大，直径达到0.33 ± 0.04mm，面积为0.081 ± 0.019mm2。免疫组织化学（IHC）分析证实，类器官内的透明区域是增殖性的，含有Ki67+细胞，并对神经前体和径向胶质标记物Sox2显示出丰富的免疫反应性，表明存在VZs。基因表达分析显示在整个分化和成熟过程中存在神经前体。VZs的大小在分化过程中增加，并在成熟过程中保持稳定，2个月大的类器官中直径平均大小为0.13 ± 0.03mm，面积为0.012 ± 0.005mm2。这项研究提供了有关hCOs中VZs随时间变化的形态变化和发展的见解，强调了这些类器官结构在成熟过程中的动态性质。 图2 hCOs的形态和心室区（VZs）在分化和成熟过程中的发展。（a）hCOs在分化和成熟（1个月和2个月）过程中的代表性明场图像。VZs用白色虚线标记。（b）单个hCO的直径和面积（黑点）以及平均值（水平线）±标准差（每个条件下n=11-14个hCOs）的图表。（c）分化和成熟（1个月和2个月）hCOs中VZs的Ki67和Sox2（绿色）免疫反应性。细胞核用Höechst染成蓝色。（d）通过RT-qPCR对hCOs神经诱导、分化和成熟（1个月和2个月）过程中的MIKI67和SOX2基因表达进行相对定量。数据表示平均值±标准差（每个实验n=4；结果在两次独立实验中得到证实）。使用单因素方差分析（每组与NI组的多次比较）进行统计分析；***p<0.001；****p<0.0001。（e）hCOs发育过程中VZs的直径和面积的平均值±标准差（每个条件下n=11-13个VZ）的图表。比例尺=100µm。 1 M：（1 个月）；2 M：（2 个月）；D：分化；Hoe：Höechst；M：成熟；NI：神经诱导；VZ：心室区。 3、hCOs 中的神经发生和神经元成熟 研究中调查了人类大脑类器官（hCOs）中的神经发生和神经元成熟过程。在分化阶段观察到神经母细胞（双皮质素+，DCX+）的存在，这表明神经发生的开始。在整个成熟阶段，DCX基因的表达增加，这表明在hCO发育过程中神经发生正在进行。免疫荧光图像还显示在分化过程中存在神经元标记物，如βIIITubulin、MAP2（微管相关蛋白2）和突触囊泡标记物突触素I（SYN1），并且随着hCOs的成熟，它们的表达水平增加。这表明类器官内神经元的成熟。神经元围绕心室区（VZs）的分布，其中神经前体细胞位于中心，神经元向外迁移到地幔区，展示了hCOs中神经发生和神经元分化的典型结构。该研究证实了随时间培养，增殖的神经祖细胞分化为后有丝分裂和成熟神经元的过程。 图3 hCOs中的神经元分化和成熟。（a）在分化和1个月及2个月成熟的hCOs中，不同神经元标记物（DCX、βIIITubulin和MAP2；红色）和突触标记物（SYN1；绿色）的免疫反应性。VZs用白色虚线标记，并显示对Ki67和Sox2（绿色）的免疫反应性。细胞核用Höechst染成蓝色。比例尺=100µm。（b）通过RT-qPCR检测DCX、TUBB3、MAP2和SYN1基因的相对表达。数据表示平均值±标准差（每个实验n=4；结果在两次独立实验中得到证实）。 1 M：（1 个月）；2 M：（2 个月）；D：分化；DCX：M：成熟；MAP2：微管相关蛋白 2；NI：神经诱导；SYN1：突触素 1；TUBB3：βIIITubulin。 4、通过生物标记免疫染色和 RT-qPCR 分析 hCOs 的细胞多样性特征 在确认hCOs中存在不同成熟阶段的神经元祖细胞和神经元后，研究人员旨在调查培养物中其他非神经元细胞表型的存在。免疫染色显示，在hCOs的成熟阶段存在星形胶质细胞标记物GFAP（胶质纤维酸性蛋白）和S100β（S100蛋白亚基β）。GFAP和S100B基因表达的RT-qPCR分析显示，随着培养时间的延长，表达量逐渐增加，表明hCOs内胶质发生的开始。该研究展示了使用免疫染色和RT-qPCR技术检测和量化特定细胞标记物表达的能力，为hCOs的细胞多样性提供了有价值的见解。成熟阶段星形胶质细胞标记物的存在表明类器官内胶质细胞群体的发育，补充了hCOs中存在的神经元细胞类型。 图4 在hCOs成熟阶段（1或2个月）的脑细胞表型。（a）2个月成熟hCOs的GFAP（绿色）和S100β（绿色）免疫染色。细胞核用Höechst染成蓝色。白色箭头指示hCOs中不同标记物的免疫标记。比例尺=50µm。（b）神经诱导、分化和成熟阶段GFAP和S100B的RT-qPCR相对定量。（c）1个月成熟hCOs的CNP（绿色）免疫染色。（d）神经诱导、分化和成熟阶段OLIG2、NG2、PDGFRA、O4、GALC、PLP1、MOG和MBP的RT-qPCR相对定量。（e）1个月成熟hCOs的IBA-1（绿色）免疫染色。（f）神经诱导、分化和成熟阶段AIF1、CX3CR1、P2RY12和CD68的RT-qPCR相对定量。（g）2个月成熟hCOs的KDR（绿色）和CD31（红色）免疫染色。（h）神经诱导、分化和成熟阶段KDR、PECAM1和ICAM1的RT-qPCR相对定量。 1M：（1 个月）；2M：（2 个月）；AIF1：异体移植物炎症因子 1；CNP：CNPase；D：分化；GFAP：胶质纤维酸性蛋白；Hoe：Höechst；ICAM1：细胞间粘附分子 1；M：MBP：髓鞘碱性蛋白；MOG：髓鞘少突胶质细胞糖蛋白；NI：神经诱导；PDGFRA：血小板衍生生长因子α受体；PECAM1：血小板和内皮细胞粘附分子 1。 5、通过单细胞转录组学分析 hCOs 的细胞多样性特征 研究人员处理了来自11,079个高质量细胞的转录组数据，并根据转录相似性将这些细胞分为十个细胞簇，每个簇中的细胞数量不同。为了识别每个簇中的细胞类型，编译了主要脑细胞类型的特异性标记基因。细胞类型的分配是基于细胞类型标记签名的表达。结果使用Uniform Manifold Approximation and Projection（UMAP）表示法进行可视化，这有助于识别hCOs中的不同细胞群体。分析显示hCOs中存在多种细胞类型，包括兴奋性神经元、中间神经元、少突胶质细胞前体细胞（OPC）、星形胶质细胞、放射状胶质细胞、类似小胶质细胞和类似内皮细胞。单细胞转录组学方法提供了hCOs内细胞间基因表达变异性的全面视图，突出了这些类器官结构的细胞多样性和复杂性。展示了单细胞转录组学在表征hCOs的细胞多样性特征以及识别这些复杂的人类大脑3D模型中存在的不同细胞群体方面的强大功能。 图5 单细胞RNA测序（scRNA-seq）揭示了hCOs中细胞的身份。（a）用于在脑类器官衍生的单细胞RNA测序数据中辅助细胞类型分配的标记基因的示意图。（b）来自单细胞 RNA 测序数据无监督聚类的均匀流形逼近和投影 (UMAP) 图，可识别细胞群，并通过条形图显示每簇的比例 (%)。颜色代表注释为兴奋性神经元（EN）、中间神经元（IN）、神经元（N）、中间前体细胞（IPC）、少突胶质细胞前体细胞（OPC）、星形胶质细胞（AS）、外放射状胶质细胞和星形胶质细胞（oRG + Astroglia）、顶端放射状胶质细胞（aRG）、增殖性放射状胶质细胞（pro-RG）和中胚层（MES）的十个细胞簇。（c）点图表示细胞类型特异性标记基因的表达。点的大小代表表达该基因的细胞百分比（在图中用水平线分隔开以便于可视化显示两个不同的比例尺），从低到高（蓝色到红色）的颜色渐变表示每个细胞的平均相对表达。用方框突出显示定义每个细胞簇的感兴趣的基因。（d）特定类型基因（如小胶质细胞（AIF1）和内皮细胞（KDR））表达模式的彩色星云密度图。（e）点图显示CR（Cajal-Retzius）、CP（脉络丛）、FD（前脑背侧）、FV（前脑腹侧）、HY（海马）和MB/HB（中脑和后脑）细胞簇的标记基因的表达。 上述研究提出的方法在不同的hPSCs系中可重复，以接近100%的效率生成神经上皮结构，并产生具有正确结构和空间排列的hCOs，这与以前的研究报告相似。此hCOs模型代表了大脑中发现的细胞类型的多样性（神经元、星形胶质细胞、OPCs、类似小胶质细胞和类似内皮细胞），这使其成为一个良好的模型，可用于研究这些细胞类型的特定病理，如神经炎症、星形胶质细胞反应或脱髓鞘，这些与神经退行性变有关。此外，无论是神经发育还是大脑的不同病理，都不能在不考虑不同细胞类型之间发生的相互作用的情况下进行研究。 研究人员相信这一新方法有助于改进或克服hCOs领域的当前限制，从而促进这一创新技术的应用，并便于在任何实验室环境中执行。 参考信息 Efficient generation of human cerebral organoids directly from adherent cultures of pluripotent stem cells.J Tissue Eng. 2024 Feb 9:15:20417314231226027. doi: 10.1177/20417314231226027.PMID: 38343770 PMCID: PMC10858658. |
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