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近年来，细胞疗法已被视为最有临床前景的新兴药物模式之一，在多种复杂难治的疾病中有广泛的应用前景。TIL、CAR-T 和 TCR-T 疗法都是癌症免疫细胞治疗领域的热门研发方向。相比之下，TIL 细胞疗法在实体瘤的治疗中具有天然优势，包括肿瘤特异性靶点丰富、浸润能力强和副作用小等。 不过，传统的 TIL 疗法也存在着很大的局限性。比如，很多患者的 TIL 细胞中只有很少一部分是肿瘤特异性 T 细胞。而鉴别、分离、扩增这些 T 细胞，又面临极大的技术挑战。解决这些难题的途径之一是开发一种高效的、个性化的发现肿瘤特异性 TCR 的技术。 近日，来自荷兰癌症研究中心（NKI）和呈源生物（RootPath）的研究人员开发出了一个高通量、个性化的 TCR 发现流程，其核心在于 TCR 文库的大规模合成与肿瘤识别功能筛选的结合。研究团队利用这种方法筛选了多名患者 TIL 衍生的数千种 TCR，并鉴定出了数十种具有强肿瘤反应性的 CD4+T 和 CD8+T 细胞衍生的 TCR，包括识别个性化新抗原的 TCR。 论文中提到，这项技术的重要突破在于其将 TCR 基因合成的成本降低了数个数量级，达到了每个 TCR 基因只需 1 美元。  ▲图｜论文截图（来源：Nature Biotechnology） 该研究已经发表在 Nature Biotechnology 上。本研究的共同通讯作者之一陈曦博士是合成生物学公司呈源生物（RootPath）的联合创始人兼首席执行官。陈曦在美国得克萨斯大学奥斯汀分校获得生物化学博士学位，还曾在哈佛大学 Wyss 研究所从事博士后研究。其后作为创始团队成员加入 Ultivue Inc，还参与创立并加入巢生资本，领导了多项投资和内部孵化项目。 “这篇研究系统地展示了呈源生物独有的超高通量基因合成技术如何助力发现个体化 TCR 药物。我相信这项技术有潜力为实体瘤患者开发出更具成本优势的'下一代’ T 细胞疗法。”陈曦说。 本研究共同通讯作者 Wouter Scheper 博士也指出，此前我们只能合成几十个 TCR，利用这项新技术我们可以把通量提高 100 倍。相信这项技术可以促进人们对 T 细胞的理解以及基于 T 细胞的创新药开发。 “一锅法”组装 TCR 基因，合成成本降至 1 美元 在免疫肿瘤学研究中，评价一个 T 细胞的功效有两个最重要指标：一是 T 细胞受体（TCR）是否能识别肿瘤抗原即“正确的心智”，二是 T 细胞是否处于健康状态即“强健的体魄”，从而保证 T 细胞接触并识别肿瘤细胞后快速增殖并杀伤肿瘤细胞。 也就是说，治疗过程中，T 细胞应该同时具备“正确的心智”和“强健的体魄”。然而，在肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）中，这两种特性往往难以存在于同一个 T 细胞。 测序技术的快速发展为解决这一问题提供了思路，单细胞 RNA 测序技术使得研究人员可以轻易从成千上万个 TIL 中获取 α-β 配对的 TCR 序列信息，这些序列信息决定了 T 细胞的“心智”。获得这些序列信息之后，接下来的关键就是将其通过基因合成方式组装成编码 TCR 蛋白的基因片段。 大规模合成 TCR 基因片段理论上是一种可行的方法，但是当前合成每个 TCR 基因的成本要达到近 100 美元，合成上万个 TCR 基因价格极其昂贵。为了解决这些限制，研究团队开发了一种新的序列设计算法，并基于此算法开发了一种高通量 TCR 基因合成技术。他们利用 TCR 可变基因（V基因）的可重复使用性以及价格低廉的寡核苷酸池（oligo pool）组装出 α-β 正确配对、全长的 TCR 基因。 具体来说，研究人员采用“一锅法”组装 TCR 基因，他们利用 TCR 基因不经历“体细胞超变异”这一特点，事先合成好了人类群体中常见的 50 – 70 个 TRBV 与 TRAV 基因的 L-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 区段，并将其制备成单链 DNA 池（ssDNA TRAV_GL Pool 和 ssDNA TRBV_GL Pool），这些单链 DNA 池可以被重复利用。为合成每一组 TCR 基因（包括约 1000 个 TCR），研究人员分别订购寡聚核苷酸池 ssDNA CDR3α pool 和 ssDNA CDR3β pool，并利用其分别具备的 Zip 和 Zip* 互补序列，在均一溶液中将两组寡聚核苷酸池定向连接。 陈曦解释道，这种“一锅法”的组装方法只需要 3 个反应就能组装 1000 个 TCR，大大节约了组装成本，合成单个 TCR 的有效材料成本低至 1 美元。  ▲图 | 利用“一锅法”组装 TCR 基因的流程（来源：上述论文） 在试验中，研究人员测试出不同 TCR 基因的准确率中位数为 98.2%。他们还通过“密码子多样性化”的 FR3 区段序列实现了 CDR3α 和 TRAV_GL 的准确连接，以及 CDR3β 和 TRBV_GL 的准确连接。 不止于 TCR 基因合成，接下来研究团队将其与高通量遗传筛选结合起来，从而能够在单个实验中对上千个单个 TCR 的抗原特异性或肿瘤识别性进行功能分析。他们将 TCR 基因以“一锅法”形式导入工具 T 细胞中形成“多克隆 TCR-T ”细胞，并将此多克隆 TCR-T 细胞与负载了肿瘤抗原的抗原呈递细胞共培养 12 到 24 小时。在此过程中，带有抗原特异性 TCR 的 T 细胞会被激活并显著上调激活标记物（如 CD69, CD137 等）。此后，研究人员将上调了激活标记物的 T 细胞通过 FACS 选出，并对其中所携带的 TCR 进行测序。 利用这一流程，研究人员可以从包含 1000 个 TCR 基因的文库中有效发现抗原特异性 TCR。研究人员还证明了这一技术可以从卵巢癌、宫颈癌、肝癌病人的 TIL 样品中发现全新识别新生抗原、病毒抗原以及未知抗原的 TCR。 “这表明，这些 TCR 基因可以被工程化修饰到新鲜的 T 细胞中并正确发挥功能。当结合基于 NGS 的新型筛选技术后，我们可以迅速有效从 TIL 群体中找到 '正确的心智’，即可识别肿瘤抗原的 TCR 基因。” 相关服务即将商业化，未来计划将基因合成成本降低 1-2 个数量级 呈源生物是一家专注于基因合成和解码免疫系统的合成生物学和细胞治疗公司，于 2017 年由巢生资本孵化创立。其总部位于波士顿，在中国广州和杭州设有分公司，主要开发基因合成、解码技术和新一代免疫细胞生产技术。成立至今，该公司共获得近 7000 万美元融资，投资方包括红杉资本、经纬创投、鼎晖投资、云九资本等等。 根据官网的介绍，其已经成功开发了世界首个基于超高通量 DNA 片段组装的长序列基因合成技术和多克隆、多功能 TCR-T 细胞生产技术，同时将这些技术应用于合成免疫学平台，可用于开发新一代个体化、多克隆、肿瘤反应性 T 细胞疗法。 该公司的底层技术包括 PathFinder DNA 组装™ 和 Nano Toothpick™，其中前者是一种自下而上合成基因的过程，将组装方案分子编程到 DNA 链的序列中，从而使数以万计的短 DNA 链可以同时以高精度自组装成数千个长基因；后者检查合成基因产物的每个碱基对，通过筛选数百万个虚拟菌落实现无差错的基因合成。 基于这些技术，该公司可以为每位患者生成包含数千个 TCR 的文库、建肿瘤免疫库、对患者进行功能筛选、识别肿瘤反应性 TCR，并合成 “合成型”TIL。陈曦表示，论文中提到的 TCR 基因合成和功能筛选服务正处于测试阶段，即将正式商业化。事实上，一些早期测试客户已经使用了这项服务并获得了满意的结果。 “TCR 基因合成只是我们底层技术的一个应用方向，我们已经将应用范围从 TCR 基因拓展到了任意序列的基因，并在 2023 年 10 月商业化发布了呈源定制基因库。”  ▲图 | PathFinder 定制化基因库™工作原理（来源：公司宣传材料） 陈曦还告诉生辉 Synbio，呈源定制基因库可将基因合成的成本降低到每碱基 0.2-0.3 元，不到市场上现行价格的一半。此前基因从头合成的价格大约在 0.6-1 元/bp，这就意味着，合成含有 300 个平均长度为 1.5 kb 的基因将花费人民币 27 万至 45 万元，而呈源生物可将这一价格降低 9 万至 13.5 万元。  ▲图 | 呈源定制基因库介绍（来源：公司宣传材料） “我们会不断发展更便宜、更快速的基因合成和筛选技术，并将逐步利用这些技术为客户服务。在未来 10 年内，我们计划将基因合成的成本降低 1-2 个数量级，将基因功能鉴定的通量提高 1-2 个数量级。这篇研究是我们在这一旅程中的一个重要里程碑。” “这种新方法可以助力识别肿瘤抗原特异性 TCR，有望成为一种设计未来细胞免疫疗法的强大工具。在 GLP 操作规范下，预计我们能在 4-5 周内发现治疗性 TCR，这是一个重要的进步。” 素材来源官方媒体/网络新闻 免责声明：本文旨在传递合成生物学最新讯息，不代表平台立场，不构成任何投资意见和建议，以官方/公司公告为准。本文也不是治疗方案推荐，如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。 |
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