【原】特别关注｜胰腺癌动物模型的比较与选择

临床肝胆病杂志 2024-04-28 发布于吉林

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胰腺癌(PC)是常见的消化系统恶性肿瘤，起病隐匿、恶性程度高、化疗反应差、疾病进展快，加之胰腺的解剖位置特殊、肿瘤切除率低，因此PC极易复发、预后极差。当前急需寻找高效的治疗手段遏制PC的进展, 而开展大量临床和基础研究以明确PC的发病机制是提高其临床疗效的重要前提。目前，用于PC相关基础研究的动物模型主要分为化学药物诱导、移植瘤和基因工程三类。本文将对各种常用的PC动物模型进行比较，旨在为PC研究中动物模型的选择提供一定的依据。

1化学药物诱导模型

化学药物诱导模型是通过化学致癌剂使细胞发生恶变从而建立PC模型，常用的化学致癌剂有：N-亚硝基双(2-氧丙基)胺[N-nitrosobis(2-oxopropyl)amine, BOP]、7, 1 2-二甲基苯并蒽(7, 1 2-DMBA)等。

1.1 N-亚硝基双(2-氧丙基)胺(BOP)诱导

BOP是二正丙基亚硝胺(di-N-propyl nitrosamine)的一种β-代谢物，多种研究显示，BOP具有“广谱”致癌作用，但其致癌作用机制尚未完全清楚。

卫积书等采用BOP(20 mg/kg，1次/周，4周)对叙利亚仓鼠进行腹壁皮下注射，20周时仓鼠总体胰腺成瘤率仅为17.64%，且发现实验鼠均不同程度产生了肝硬化，说明高剂量BOP的副作用较大，容易诱发其他器官病变，且PC的诱发率并不够高。而马青松等在仓鼠皮下注射低剂量BOP(10 mg/kg，1次/周，7周)，结果发现25周后总成瘤率为81.3%，部分实验鼠出现了黄疸、体质量减轻及远处转移等PC相关临床表现。随后大量实验表明，10 mg/kg BOP是目前诱导PC动物模型较为合适的给药剂量，但适宜的给药时间尚未形成统一共识。BOP皮下注射诱导PC操作较为简单，但由于其广谱致癌性，易导致并发其他器官的病变。

1.2 DMBA诱导

DMBA具有强力致癌作用，其在生物体内代谢转化的生成物可以与DNA共价结合，致使DNA损伤与染色体畸变, 从而诱发癌基因和抑癌基因突变，导致肿瘤的发生。

夏蜀珺采用DMBA(5 mg)晶体缝合入SD大鼠胰腺被膜下，2周后18.8%实验鼠镜下可观察到胰腺上皮内瘤变，37.5%实验鼠发生了PC，1个月后PC发生率约76.5%，该方法造模时间较短，且高效地呈现了不同时期的PC病变。

DMBA诱导的PC不引起其他脏器肿瘤，且具有较高的基因突变发生率，与人类PC的病理进展过程相似，造模可以完整观察到各个阶段PC病变发展，但手术操作较为复杂。目前造模常用剂量为7~9 mg。

2移植瘤模型

移植瘤模型是指将PC细胞株或组织植入实验动物胰腺或皮下，建立原位移植瘤模型或异位移植瘤模型。

2.1 原位移植瘤模型

研究发现，PC原位移植小鼠模型保持了人类肿瘤的结构及其原始的抗原表型。王兆洪等将瘤块植入BALB/c小鼠胰体尾部，4周后成瘤率100%，肿瘤与周围组织轻度黏连，未出现转移。随后张贺等通过原位植入瘤块于裸鼠胰腺，发现该方法所造模型临床同质性高，与人类PC的特征接近，有利于对PC疗效进行全面、长期评估, 更深入地研究PC发病机制。

由于新鲜临床PC标本较难获取，目前多选用PC细胞系复制原位移植瘤模型。而小鼠胰腺原位注射是该模型制作中的难点，其原因在于小鼠胰腺结构较薄，局部注射容易造成癌细胞泄漏，形成腹内传播。因此，提高胰腺原位注射效率具有重要的意义。有研究采用Matrigel基质胶重悬癌细胞解决这一难题，Matrigel被注射入活体组织后，可随着局部组织温度的升高转变为凝胶状态，从而有效防止注射点渗漏，降低了PC腹腔种植的风险，且实验对比发现Matrigel组小鼠成瘤率远高于原发性胆汁性胆管炎组。因此低温Matrigel重悬癌细胞注射法是目前建立小鼠原位PC模型的有效方法。

2.2 异位移植瘤模型

与肿瘤细胞的原位移植相比，皮下移植模型较为容易观察肿瘤的生长情况。Guo等将人源胰腺肿瘤组织碎片植入NSG裸鼠两侧腋下, 6个月后约71%的小鼠成功产生移植瘤。除此之外，大量研究也采用了皮下接种不同的肿瘤细胞系至BALB/c小鼠复制PC模型。

近年来研究者采用多种免疫缺陷型小鼠(肿瘤细胞移植时免疫排斥反应较弱，有利于形成肿瘤)构建移植瘤模型，但免疫缺陷小鼠体内存在多种免疫细胞功能障碍，而大量研究表明，肿瘤微环境与肿瘤的生长具有密切关系，所以此类模型可能无法模拟肿瘤细胞生长的微环境，在PC相关研究中存在一定的局限性。

2.3 人源异种移植(PDX)模型

为解决上述问题，研究者建立了PDX模型, 该模型依赖于将手术或活检获得的人源肿瘤标本直接移植到免疫低下的小鼠体内，当瘤块长至2 cm时，取瘤块移植于另一免疫缺陷小鼠，45 d左右即可成功构建PDX模型。此模型保留了肿瘤内异质性和复杂的微环境, 良好保存了患者肿瘤标本的形态特征，具有更可靠的临床预测价值。

3基因工程模型

基因工程小鼠模型是利用基因敲入、替换或敲除技术，替换、敲入或敲除某些特定基因从而诱导实验动物产生相应的表型变化。

RAS基因是第一个被发现的人类肿瘤基因, RAS基因突变后可使RAS蛋白持续处于活化状态，导致细胞持续增生而发生肿瘤。研究发现95%的胰腺导管腺癌(PDAC)患者存在RAS家族成员KRAS基因突变，KRAS基因突变已经被认为是PC中突变最早、概率最大的原癌基因。PC典型的突变是KRAS基因第12位点密码子的突变激活, 即K-Ras^G12D。

P53是人类最常见的抑癌基因，突变的p53可促进WNT/β-catenin信号传导，驱动PDAC转移。Kim团队采用P53基因的突变体Trp53^R172H与KRAS基因的突变体K-Ras^G12D组合构建了LSL- Kras^G12D; p53^wm^R172H/+小鼠，发现与体细胞p53缺失相比，突变体p53^R172H显著增加了PDAC在小鼠体内的侵袭转移。近来研究发现，造血信号转导因子Vav1在PDAC中表达较高，Salaymeh等研究发现与K-Ras^G12D转基因小鼠相比，Vav1/K-Ras^G12D共表达转基因小鼠可观察到腺泡-导管化生(ADM)启动的显著增加，胰腺恶性肿瘤发病率更高，恶性病变出现的时间更短，停止Vav1的表达后胰腺肿瘤恶性病变显著消退，表明Vav1是产生和维持ADM所必需的，Vav1与K-Ras^G12D共表达可促进模型向PC发生发展。

转基因小鼠模型给癌症研究带来了革命性的变化，但由于小鼠胰腺体积与人的胰腺存在巨大差异，限制了PC小鼠模型在外科或放射治疗研究中的应用。相比于啮齿动物，Principe等认为猪在解剖学、生理学和免疫学方面与人类的亲缘关系更近，并有可能更准确地模拟人类的各种疾病，该课题组所诱导的猪胰腺肿瘤具有与人类PDAC一致的形态特征，同样伴有致密的促结缔组织增生性肿瘤间质病变，加之人和猪免疫系统之间具有相似性，因此转基因猪有可能为临床前免疫治疗提供一个更好的平台。

基因工程PC模型的转移模式与人类PC相似，可用于研究早期PC的发生发展，该模型极大地扩展了临床对PC的认识，且基因工程模型可根据研究需要特定敲除或敲入某一特定基因，有望成为识别和评估新的基因靶向治疗策略的重要工具，但由于基因工程模型设计难度较大，操作复杂，难以大量造模，且成本较高。以上局限性限制了此种模型在PC发生机制和治疗策略研究中的应用。

4类器官培养模型

目前，对PC发病机制的认识还不够深入，迫切需要一种合适的模式来探讨PC发生发展的相关机制。长期以来肿瘤机制探讨中使用的细胞学研究多为传统的2D(二维)细胞培养方式，这种单一细胞培养模式无法模拟肿瘤组织的关键特征，且物种间的差异可能导致许多在动物宿主中成功的治疗方法对人类无效。近年来，类器官培养实现了患者肿瘤细胞体外培养的重大突破。类器官模型通过3D(三维)细胞培养系统进行培养，形成与体内来源的组织或器官高度相似的细胞球体，包含多种细胞，更适宜模拟肿瘤组织微环境。

Boj等将肿瘤组织剪碎，在含Wnt3a、RSPO1、50 ng/mL的表皮生长因子等的完全培养液中消化为单细胞后，将细胞包埋于GFR Matrigel中，用添加1 μmol/L的前列腺表E2培养液进行培养形成类器官，将其原位移植于免疫缺陷小鼠后，观察到肿瘤类器官从癌前病变逐步发展为浸润性和转移性癌，重现了肿瘤发展的全过程，因此可通过类器官建立不同阶段PC模型，为PC不同发展阶段机制的研究提供新的平台。Huang等使用外科手术切除的20个原发肿瘤标本建立类器官培养，在Matrigel中诱导细胞分化，使用含1% B27, 50 μg/mL抗坏血酸, 100 ng/mL FGF2等的DMEM进行培养后，肿瘤类器官模型的成功率可以达到80%以上，该研究还发现类器官不仅与原发肿瘤表现出相似的形态和细胞结构，还表达其来源的原发肿瘤的分化标志物，如KRT19、GATA6和SOX9，因此认为胰腺肿瘤类器官可被用来监测PC的临床治疗反应，为PC的个性化治疗提供支撑。

类器官模型与体内来源组织或器官高度相似，可以保留来源组织或器官的基因组特征和部分生理功能，但截至目前该模型造模技术尚未成熟，造模所需的基质胶、生长因子及具体操作步骤还未实现标准化，PC类器官模型所构建的肿瘤微环境仍缺乏血管及免疫细胞不足，这与PC患者的肿瘤微环境还存在一定的差距，需要进一步深入探索。

以上所述相关的PC造模方法各有优缺点，现将其整理为表1。

5问题与展望

理想的动物模型对阐明PC的发病机制、优化PC的诊断和治疗方案具有重要的意义。目前已有的动物模型可以模拟多数人类PC的特征，在此基础上所开展的大量研究推动了PC的研究进展，但上述相关动物模型各有优缺点，目前常用的造模方法为裸鼠皮下移植，异位移植模型操作简单，便于检测肿瘤情况，但无法模拟胰腺肿瘤微环境, 而PDX模型的发展解决了这一问题，且沈晔华等通过建立PC PDX模型发现，清胰化积方可诱导癌细胞凋亡，从而增强吉西他滨的疗效，并在此前期研究的基础上，将清胰化积方用于临床治疗，发现清胰化积方确实可有效增强患者的带瘤生存时间。为了更靶向地研究PC相关基因，基因工程小鼠模型应运而生，但其造价昂贵，无法进行大规模实验。类器官技术的发展为PC研究提供了新思路，有望创造出更加接近于人类PC病理结构和微环境改变的动物模型，为PC的研究和临床诊疗提供更加有力的支撑。