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本文，我们将讨论对洗脱机溶剂比例该如何优化，以得到最理想的Rf值条件。同时在这样的条件下，BiotageFlash快速制备色谱系统可以使得纯化分离效率最大化，更大上样量，更小溶剂消耗量，提高分离效果。 我们知道，对于化合物的分离而言，流动相溶剂的选择至关重要，它会直接影响到化合物的分离效果。那么在在流动相已经做好选择之后，纯化的关键就到了流动相比例摸索和确定。这一步的优化不仅可以提高上样量，同时可以减少溶剂消耗量，节约时间和能源，进一步提高Flash纯化效率，很多用户反映说Flash并没有非常节省溶剂的原因主要出自这里。
每一次的纯化分离当中，目标化合物都是从其他杂质中分离纯化而来，但是并不是每一次的纯化都是最优条件，为了能够有快速的分离以及节约溶剂，找到最佳的优化条件是非常必要的。 当每次我们对纯化条件进行优化的时候，TLC薄层色谱是最行之有效的方法，首先在选定的溶剂体系中，需要对溶剂比例进行调整，做到目标产物的Rf值保持在0.1-0.4之间（薄层色谱中，溶剂从原点渗透到距离a的时候，如果位于原点的物质从原点向前移动到b，那么b/a的值（0.0—1.0）就是这种物质的Rf值），Rf值的大小反应了目标化合物在对应条件下的保留难以程度，数值越大越不易保留；在Flash纯化中，我们常常使用柱体积（CV，之前的文章中，有提过柱体积的概念）的多少来表示保留的难易程度，那么我们知道的是，对于Rf=0.2的化合物的条件下，要将它从flash色谱柱中相同条件下洗脱下来，需要的柱体积应该是1/Rf=5的柱体积；根据他们的定义，CV值=1/Rf，根据这个公式，我们就可以算出相邻两个化合物之间的柱体积之差 ΔCV= 1/Rf2 – 1/Rf1 ΔCV= CV2 – CV1
举例：如上图，五种组分的化合物在不同溶剂条件下（10%,20%, 30%, and 40% ethyl acetate in hexane）进行薄层板展开实验，乙酸乙酯的含量越大，保留越弱，Rf值越大，ΔCV越小，越不易分离。从图中看，五种化合物在TLC板中都已经分离开，但是并不是每一种条件都可以应用到Flash柱层析当中，一般情况下，我们需要选定将Rf值应处于0.1-0.4之间，以化合物3为目标化合物而言，只有10%EA和20%EA的条件符合规则。
即使已经掌握的合适的Rf和CV条件的情况下，分离方法也不一定就是完全合适，还需要看ΔCV值，这反应了相邻化合物之间的分离度，只有在最后确定了ΔCV值是出于有效范围之内，才能化合物可以得到非常有效的分离，另外，ΔCV值越大，此方法条件的载样量就会越大，所以ΔCV的选取至关重要，他不仅保证了化合物的分离，同时还进一步了加大了载样量，节省溶剂和时间成本。 上表中，化合物3为目标化合物，在10%EA和20%EA的两种条件下，其Rf值分别为0.15和0.32，相应的CV值分别为：6.5；3.13，为了确定更好的分离效果，我们需要计算化合物3与化合物2、4之间的ΔCV值，可以发现在10%EA的条件下，ΔCV（VS compound2）=3.9；ΔCV（VS compound4）=10.83；而在20%EA的条件下，ΔCV（VS compound2）=1.04；ΔCV（VS compound4）=1.42；数值小太多，会非常限制样品的分离纯化量。 Biotage制定了不同ΔCV，对应使用的色谱柱以及纯化量，见下表：
可以发现，如果我们使用的是BiotageSNAP 10g常规色谱柱，20%的条件下，样品的最大的纯化量不能超过100mg，而如果ΔCV值在4以上（10%EA条件下），纯化量可以达到500-1000mg。用户可以根据表格信息，自行选择色谱柱和溶剂纯化条件。 我们分别用这两种条件进行了对比实验：
100mg样品，BiotageSNAP 10g 色谱柱，用10%EA的条件纯化以上五种化合物
100mg样品，BiotageSNAP 10g 色谱柱，用20%EA的条件纯化以上五种化合物 从以上色谱图可以发现，20%EA条件下分离效果并不理想，只因为ΔCV值的选择并不好，而对10%EA条件下的分离就会有明显优势，化合物3在化合物2、4之间完美分来，同时另外几种化合物之间的分离也得到了完美呈现，相信在此条件下，上样量仍旧可以有一定的提升。 因此，从实验结果来看，仅仅在TLC上面显示化合物已分开的条件并不充分，我们还需要将Rf值以及ΔCV值确定下来，才能保证完美的分离。 |
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