【原】图解病理染色 | 第3期. 一文掌握纤维组织染色-masson染色详解！

上2期我们围绕“组织病理染色”分别介绍了“组织石蜡切片制备”和“经典组织病理染色——HE染色”（点击跳转），本期我们将介绍针对特殊组织类型（纤维组织）的病理染色方法。用于纤维组织的病理染色方法有多种，我们将以masson染色（masson’s trichrome stain）为主，详细介绍组织石蜡切片masson染色的实验步骤、注意事项和图解示例，简要介绍其他纤维组织染色方法。

一、染色步骤

整体来说，masson染色的制备过程涉及8大步骤：脱蜡至水 → 重铬酸钾过夜→ 苏木素染核 → 1%盐酸酒精分化 → 丽春红酸性品红染肌纤维 → 磷钼酸分化 → 苯胺蓝染胶原纤维 → 脱水+封片。下面我们来看每一个具体的步骤~

Step. 1

脱蜡至水

步骤：65℃烘箱中烤片2h后，依次将切片放入二甲苯（5分钟，3次），无水乙醇（5分钟，3次），95%乙醇（5分钟，1次），70%乙醇（5分钟，1次），双蒸水浸洗（5分钟，2次）。重铬酸钾过夜。

目的：脱去石蜡，并使样本达到适当的水分含量，便于后续染色。

注意：脱蜡要充分，脱蜡不净会导致切片着色不均。

Step. 2

重铬酸钾过夜

步骤：2.5%重铬酸钾媒染剂室温浸泡过夜（约15h）或者37℃ 2h。

目的：重铬酸钾作为媒染剂与染料发生络合反应，着色效果更好。

Step. 3

苏木素染核

步骤：配置苏木素染液，切片浸入苏木素染液5min，水洗两次至无色。

目的：苏木素使细胞核呈现紫蓝色。

Step. 4

1%盐酸酒精分化

步骤：用1%的盐酸酒精（浓盐酸：无水乙醇=1：100）分化15秒，至细胞核呈灰黑色，背景几乎无色或淡灰色。自来水稍洗，沥干多余水分。

目的：洗去细胞质里的苏木素。

Step. 5

丽春红酸性品红染肌纤维

步骤：切片浸入丽春红酸性品红染液中染色10min（如果红色过浅可适当延长染色时间），自来水稍洗20s或直接将染色液倾倒，避免过度水洗。

目的：小分子染料丽春红使组织（胶原纤维和肌纤维）呈现亮红色。

Step. 6

磷钼酸分化

步骤：切片浸入1%磷钼酸溶液中约1 min。此步为分化作用，可在镜下观察染色深浅调整时间，一般1-2 min。

目的：

1）磷钼酸可渗透进胶原纤维，较难渗透进肌纤维，可去除胶原纤维中的丽春红使其褪为淡红色至无色。

2）发挥媒染作用，使胶原纤维更容易被苯胺蓝染色。

Step. 7

苯胺蓝染胶原纤维

步骤：将磷钼酸倾倒后，不经水洗，直接用苯胺蓝溶液染色，常规组织一般2-30 s；骨组织30 s，皮肤组织60 s，根据染色程度进行调整。之后用1%冰醋酸水溶液漂洗分化三次，毎次7 s左右。第三次时镜下观察，避免蓝色过度分化。

注意：苯胺蓝溶液染色可以“短时多次”进行，避免染色过度。

目的：大分子染料苯胺蓝可渗透进胶原纤维，难渗透进肌纤维，使胶原纤维着蓝色。1%冰醋酸将多余的苯胺蓝分化，有助于产生清晰鲜艳的色调。

Step. 8

脱水+封片

步骤：步骤：将切片依次放入95%酒精（12s），无水乙醇（12s，2次），二甲苯（5分钟），将切片从二甲苯拿出来稍晾干，加中性树脂封片。在生物安全柜放置一夜后用显微镜拍照。

Tips

• 染色过程中每个步骤间进行充分洗涤，有助于防止前一步的染料残留对下一步染色产生影响。

• 染色过程中避免样本过度干燥。

• 每一步的具体染色时间需要根据样本情况进行适当调整，以达到最佳的染色效果。

总结：Masson染色流程图

二、染色特点

其他纤维组织染色方法还包括：Van Gieson染色、网状纤维染色、弹力纤维染色（EVG染色）、天狼猩红染色、磷钨酸-苏木素染色等。

三、图解示例

通过masson染色，使纤维组织呈现出不同的颜色，可以帮助我们进一步了解病变的过程。图中展示了心肌组织石蜡切片masson染色情况。

原文图注：J. Representative Masson trichrome staining in peripheral and interstitial area.

原文描述：Similarly, Masson trichrome staining showed that rAAV9-USP28 injection significantly attenuated cardiac fibrosis in db/db mice, as evidenced by reduced LV collagen deposition. However, USP28 cannot improve myocardial fibrosis in PPARα knockout db/db mice (Figure 7J-K).