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大家好，今天给大家介绍的这一篇题为 Eosino phils promote pulmonary matrix dest ruction and emph ysema via Cathe psin L（嗜酸性粒细胞通过组织蛋白酶L促进肺基质破坏和肺气肿）血液嗜酸性粒细胞水平升高的慢性阻塞性肺病 (COPD) 患者通常会出现肺功能恶化和更严重的肺气肿，这意味着嗜酸性粒细胞可能参与肺气肿的发展。 01 研究背景 慢性阻塞性肺疾病 （COPD） 患者如果血液嗜酸性粒细胞水平升高，通常会出现肺功能恶化和更严重的肺气肿。这意味着嗜酸性粒细胞可能参与肺气肿的发展。然而，嗜酸性粒细胞介导的肺气肿发展的确切机制仍不清楚。在这项研究中，我们采用单细胞RNA测序来鉴定哮喘和肺气肿小鼠模型中的嗜酸性粒细胞亚组，然后对这些亚组进行功能分析。 对积累的嗜酸性粒细胞的评估揭示了弹性蛋白酶诱导的肺气肿和卵清蛋白诱导的哮喘小鼠肺部的不同转录组。通过使用抗白细胞介素-5抗体来消耗嗜酸性粒细胞，改善弹性蛋白酶诱导的肺气肿。一个特别值得注意的发现是嗜酸性粒细胞衍生的组织蛋白酶L有助于细胞外基质的降解，从而导致肺组织中的肺气肿。在小鼠模型中，组织蛋白酶L的抑制导致弹性蛋白酶诱导的肺气肿减少。重要的是，嗜酸性粒细胞水平与血清组织蛋白酶L水平呈正相关，肺气肿患者的嗜酸性粒细胞水平高于无肺气肿患者。 嗜酸性粒细胞中组织蛋白酶L的表达与COPD患者肺气肿直接相关。总的来说，这些发现强调了嗜酸性粒细胞来源的组织蛋白酶L在细胞外基质降解和重塑中的重要作用，以及它与COPD患者肺气肿的相关性。因此，靶向嗜酸性粒细胞衍生的组织蛋白酶 L 可能为肺气肿患者提供治疗途径。有必要进行进一步的研究，以探索针对肺气肿患者组织蛋白酶 L 的治疗策略。 见图一 嗜酸性粒细胞在慢性弹性蛋白酶诱导的肺气肿中积聚。  图一 a一种弹性蛋白酶（0.5U / 100μL）每周鼻内给药给C57BL / 6小鼠，连续四周。终末分析在初次激发后 3 天（急性损伤模型）或最后一次激发后（肺气肿模型）进行。 b 肺组织学切片进行苏木精和伊红 （HE） 和维多利亚蓝 （VB） 染色以表征（所有面板的原始放大倍数×1000，条形代表 100 μm）。 c 平均线性截距和 d 治疗小鼠肺的弹性蛋白纤维含量。e 分离完整的肺细胞，并使用流式细胞术分析嗜酸性粒细胞 （CD11cSiglecF）、中性粒细胞 （CD11bLy6G） 和肺泡巨噬细胞 （CD11cSiglecF） 水平。 f， g 肺组织中对照组和急性损伤组 f 之间或对照组和肺气肿组之间差异表达的簇状基因表达标记物的热图 g.这些数据代表了三个独立的实验。数据为均值±秒 P < 0.05、P < 0.01 和 P < 0.001，使用双尾非配对 t 检验。在a-e中，n = 每组6只小鼠。 见图二 肺细胞亚群的表征。  图二 a 将小鼠随机分为四组以鉴定肺组织中的细胞类型：哮喘模型、PPE 肺气肿模型、PPE 恢复模型和对照组（每组 n = 6）。对每组从一只小鼠中分离出的整个肺细胞进行scRNA-seq分析。基于原代细胞簇着色的单细胞的 tSNE 图。 b 不同细胞类型差异表达标记基因的热图。 c 嗜酸性粒细胞单细胞RNA测序与大量RNA测序之间共享细胞类型的相关系数分析。 d 肺气肿小鼠肺组织样本中 ECP（红色）的免疫荧光染色，Rnase2a、C1qa 和 Alox15 mRNA（绿色）和 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色）的原位杂交。低倍率和高倍率的比例尺分别为 50 μm 和 20 μm。图像代表 6 个肺气肿样本。 e 小提琴图说明了所选标志物在嗜酸性粒细胞中的表达。 f t-SNE 图概述了肺组织中的嗜酸性粒细胞类型。 g 嗜酸性粒细胞中上调基因的富集基因本体 （GO） 功能。 见图三 表征嗜酸性粒细胞的不同状态。  图三 a 一种嗜酸性粒细胞单细胞亚组的随机邻域嵌入 （SNE） 图。 b 嗜酸性粒细胞的发育假时间使用 Monocle 2 分析确定。基于簇的单片伪时间轨迹。 c 使用不同体验模型着色的单片眼镜伪时间轨迹。 d 肺嗜酸性粒细胞内假时间相关基因的假时间动力学。每一行都根据其在伪时间期间的最大值进行标准化。来自三个模块的基因集的聚合表达模式。来自三个模块的基因集的富集 GO 术语在侧面进行了说明。 e 来自不同实验模型的细胞状态和嗜酸性粒细胞比例。 f， g 分化过程中显著抑制或激活的基因，根据细胞状态着色。 见图四 与嗜酸性粒细胞成熟和分化相关的转录因子。  图四 a 一种热图描绘了每个模块的监管活动。从蓝色到黄色的颜色渐变表示从低到高的不同活动水平。 b 连接特异性指数矩阵（CSI）强调了各种实验模型中不同细胞类型中调控子之间的相关性。调节子的分层聚类已经确定了四个不同的调节子模块。 c 模块 3 中转录因子 （TF） 靶基因差异表达受体之间的推定通讯。 d 模块 3 上调基因的富集 GO 功能。 e 模块 4 中 TF 靶基因差异表达受体之间的推定通讯。 f 模块 4 上调基因的富集 GO 功能。 g 嗜酸性粒细胞的透射电子显微镜图像。红色箭头表示具有电子透明晶核的致密棒状颗粒。蓝色箭头突出显示了具有代表性的嗜酸性粒细胞颗粒，其核心染色逆转，其特征是在没有颗粒融合和颗粒内容物特异性释放的情况下逐渐排空分泌颗粒。绿色箭头表示来自肺气肿模型的嗜酸性粒细胞中的细胞质囊泡。 见图五 嗜酸性粒细胞缺失可降低肺实质中的肺气肿水平。  图五 小鼠每周一次气管内滴注猪胰腺弹性蛋白酶（PPE），持续4周。每只小鼠在PPE治疗前12小时接受静脉注射200μg抗IL-5或对照IgG。 a 使用苏木精和伊红 （H&E） 以及维多利亚蓝 （VB） 对肺部病理切片进行染色，随后在指定的放大倍率下可视化（比例尺：100 μm）。 b 在IL-5阻断后，对治疗小鼠肺部的平均线性截距和c弹性蛋白纤维含量进行定量。 d 使用流式细胞术测定接受指示治疗的小鼠肺中嗜酸性粒细胞的比例和绝对数量。 e 用抗 IL5 单克隆抗体或非特异性对照 IgG 预处理的小鼠肺中的中性粒细胞计数。 f， g 动物每周接受 PPE 气管内滴注，持续 4 周。在最后一次挑战后 3 天进行终末分析。评估 H&E 染色肺切片的平均截距长度 （Lm），并且宽型 （WT） 小鼠和嗜酸性粒细胞缺陷 （PHIL） 小鼠肺中的肺泡空间增加。比例尺：200μm。数据代表三个独立的实验。数据表示为平均值± s.e.m. P < 0.05、P < 0.01 和 P < 0.001 值是使用双尾非配对 t 检验确定的。 见图六 组织蛋白酶 L 水平在 PPE 诱导的肺气肿的嗜酸性粒细胞中增加。  图六 a两个典型的嗜酸性粒细胞颗粒基因的表达。 b 动物每周一次气管内滴注PPE，持续4周。在PPE攻击后的第3天对小鼠实施安乐死，收集样本，并对ECP和CTSL切片进行免疫组化实验。比例尺表示 100 μm。 c 动物每周接受气管内滴注 PPE，持续 4 周，并在最后一次挑战后的第三天处死。对 WT 和 PHIL 小鼠获得的肺组织样本进行免疫荧光分析，以评估 CTSL、Rnase3 （ECP） 和 DAPI 标记。这里图示的是两组小鼠的并排图像。原始放大倍率如下：第 1 至第 3 条车道描绘标准视图，第 4 条显示指定区域的放大图像（低放大倍率和高放大倍率的比例尺分别为 50 μm 和 20 μm）。 d 评估CTSL荧光强度，并指示任意单位。 e 对 Pro-CTSL 和 CTSL 进行免疫印迹，其中 ACTB 作为肺的对照。这些数据代表三个独立的实验，并表示为使用双尾 t 检验确定的平均值 ± s.e.m. *P < 0.05、**P < 0.01 和 ***P < 0.001。 见图七 来源于嗜酸性粒细胞的组织蛋白酶 L 对肺气肿至关重要。  图七 a，b 在第一次滴注 PPE 前 12 小时用 500 μg CTSL 抑制剂（SID 26681509，四分之一水合物）预处理的小鼠肺或载体对照中检查平均线性截距。 比例尺：200μm。 c、d 在小鼠肺中检查嗜酸性粒细胞计数和中性粒细胞计数。 e 给小鼠施用AAV-CTSL（5×1012vg/mL） 在 60 μL PBS 中通过气管内 （i.t.） 给药在肺气肿模型建立前 14 天在肺部引起 CTSL 表达。用对照腺相关病毒处理对照小鼠。在第三次挑战后的第 3 天，动物每周接受 PPE 或 PBS 的气管内滴注，持续 3 周。处死后，检查对照组、对照组-si-CTSL、肺气肿-si-NC组和肺气肿-si-CTSL组肺组织中的CTSL表达。 f 治疗小鼠肺中的平均线性截距。比例尺：200μm。g 组织蛋白酶酶活性每隔 5 分钟评估一次，专门用于监测自淬灭 BODIPY FL 偶联牛颈韧带弹性蛋白产生 BODIPY FL 标记的荧光弹性蛋白片段。 h 还评估了组织蛋白酶活性，以从 FITC 标记的 I 型胶原生成异硫氰酸荧光素 （FITC）。这些数据来自三个独立实验，并突出显示为平均± s.e.m. *P < 0.05、**P < 0.01 和 ***P < 0.001 使用双尾 t 检验进行分析。 见图八 嗜酸性粒细胞中的CTSL表达与COPD患者的肺气肿有关。  图八 a通过Spearman相关性（n = 56，r = 0.627，P < 0.0001）分析肺密度 指数与血液嗜酸性粒细胞 水平之间的关联。 b 对健康对照和 COPD 患者的肺组织进行 CTSL（红色）、MBP（绿色）和 DAPI（蓝色）染色，并量化 CTSL 染色强度。 c CTSL荧光强度，显示任意单位。比例尺：50μm。 d， e 比较伴或不伴肺气肿的 COPD 患者血清 CTSL （P < 0.001） 和 CTSS （P = 0.0046） 水平。 f、g 血清总CTSL（r=0.327，P<0.0001）、CTSS（r= 0.151，P=0.071）与嗜酸性粒细胞水平之间关系 的Spearman秩相关分析。数据表示平均值 ± s.e.m. *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001 值是使用 Mann-Whitney U 检验确定的。 02 研究结论 总之，这些发现概述了在不同疾病微环境中区分成熟嗜酸性粒细胞转录状态的第一个参考图。嗜酸性粒细胞衍生的 CTSL 对 ECM 降解和重塑至关重要，导致肺气肿的发展。这项研究强调了CTSL作为肺气肿患者治疗靶点的潜力。 好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。 |
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