细胞“分离技术”介绍

南岸未阴 2024-05-13 发布于广东

展开全文

往期回顾：

［1］“Southern印迹”的具体方法

［2］illumina文库的“画圈”

［3］“多糖多酚”是个什么概念？

细胞的分离是指根据细胞所具有的特性把某种特定的细胞亚群从混合的细胞样品中分离出来的一种技术，它是对某一特定细胞进行生化分析和功能分析的前提和基础。

细胞的分离根据其大小、密度、表面电荷、吸附能力或表面抗原的差异等，总体上可分为三种：基于细胞不同黏附特性的分选技术、基于细胞物理性能的分选技术和基于生化亲和力的细胞分选技术。

一、基于细胞不同黏附特性的分选技术

黏附于某些固相物质如玻璃或塑料的表面,是某些类型细胞的基本生物学特性之一，但另一些细胞却缺乏这种能力，或某些细胞的黏附能力强、黏附作用快，而另一些细胞黏附能力弱或黏附作用慢。

根据这些差异，可以分离或消除某些类型的细胞。这种将黏附较快的细胞与黏附较慢（或无黏附能力)的细胞分开并分别收集的处理过程就称为差速黏附处理。

差速黏附处理常用于分离细胞悬液中的成纤维细胞与其他组织细胞。

另外，葡聚糖凝胶G-10也可用来分离细胞，其原理同样是利用细胞的黏附特性，使之黏附于葡聚糖凝胶从而将异质性细胞悬液中具黏附能力的细胞去除。

二、基于细胞物理性能的分选技术

该方法通常基于细胞本身的物理特性（如大小或密度等），在外部作用（如声波、流体动力和电场等）条件下，对目标细胞进行分离纯化。如通过密度梯度离心分选不同沉降系数的细胞、通过过滤分选不同大小的细胞。

1、过滤法(细胞筛法)

过滤法使用孔径6.5-8μm的细胞筛过滤，分离出体积较小的细胞和体积较大的细胞。

2、离心技术

离心技术是利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使样品中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒得以浓缩或与其他颗粒分离。这里的悬浮颗粒可以是悬浮状态的细胞、细胞器、病毒和生物大分子等。

当离心机驱动时，样品溶液做匀速圆周运动，产生一向外的离心力。由于不同颗粒的质量、密度、大小及形状等各不相同，在同一固定大小的离心场中沉降速度也就不同。

大于周围介质密度的颗粒将离开轴心方向而发生沉降，而低于周围介质密度的颗粒移向轴心方向而发生漂浮，从而实现相互间的分离。

1）影响离心力的因素

影响离心力的因素有相对离心力、转速、离心半径R、离心时间等。(Fc) = m×r×ω²(m,质量；ω,角速度,等于2πrpm)。

相对离心力(RCF)：在离心力场中，作用于颗粒的离心力相当于地球引力的倍数，以g为单位。转速(rpm)：离心时每min旋转次数，单位为r/min。转换公式：g=r×11.8×10⁻⁶×rpm²，r为有效离心半径，即从离心机轴心到离心管底的长度，单位为厘米（cm）。

离心力作用于微粒上，具有时间积累效应，对同一悬浮液可以在较低转速较长时间得到以较高转速较短时间条件下相同的分离效果。

由于某些待分离物质在长时间离心时容易失去生物活性，因此我们往往需要根据待分离物质的具体特点选择适合的转速和分离时间的组合。

2）差速离心法

差速离心差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。

差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。通过差速离心可将细胞器初步分离，由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。

2）密度梯度离心

密度梯度离心是用一定的惰性介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。

密度梯度离心中样品组份的分离是借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的。

密度梯度离心使用一种转速，而差速离心使用多个离心转速。密度梯度离心适宜分离密度有一定差异的样品，而差速离心则适用于分离混合样品中各沉降系数差别较大的组分。

①速度沉降

速度沉降是利用不同颗粒在梯度介质中的沉降系数的不同而分离，具有相同沉降系数的颗粒将处于同一梯度层。主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。

这种方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度，而且在最大颗粒沉降至管底前须停止离心。

②等密度沉降

等密度沉降适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。等密度沉降通常在较高密度的介质中进行。

介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度，而且介质的梯度要求较高的陡度，不能太平缓。再者，这种方法所需要的力场通常比速率沉降法大10-100倍，故往往需要高速或超速离心，离心时间也较长。

大的离心力、长的离心时间都对细胞不利。大细胞比小细胞更易受高离心力的损伤，而且停留在等密度介质中的细胞比处在移动中的细胞受到更大的损伤。因此，这种方法适于分离细胞器，而不太适于分离和纯化细胞。

③密度梯度离心介质

密度梯度离心常用的介质有蔗糖、氯化铯（CsCl）、聚蔗糖（Ficoll）、Ficoll-Paque(泛影酸钠)、聚乙烯吡咯烷酮包被的硅胶（Percoll）、碘化介质（如Nycodenz、metrizamide）等多种。

用于分离细胞的密度梯度材料应该具备一定的条件：对细胞无毒性；不会渗入细胞内部；易从收集液中除去分离介质；较低的黏性系数；PH中性或易调为中性；梯度液必须是等渗的，沿整个离心管长度方向渗透压变化要小于10%，以保证其基本性状在离心分离前后基本一致。

a.氯化铯

氯化铯是一种重金属盐、易溶于水，可形成1-1.9g/cm3的密度梯度。氯化铯溶液在离心后会自行形成并保持一个自上而下的连续密度梯度，其中顶部浓度较低，而底部浓度较高。

其原理是离心过程中产生强大的离心力使氯化铯盐向离心管底沉降。由于离心的作用管底盐溶液浓度高，所以在离心场中盐还受到扩散作用向管口移动其扩散的作用力肯定比离心力要小得多，但如果离心时间足够长，沉降和扩散之间就会达到一个平衡，这时从管的顶部到底部形成了一个线性的密度增加的梯度。

氯化铯的高密度和稳定的梯度特性得益于其较大的离子半径和相对松散的电子结构，这使得氯化铯的电荷密度较小，能够与其他离子形成更紧密的晶格结构，从而增加溶液的密度。

将含有生物大分子和氯化铯的均匀溶液注入离心管中，经过足够时间的离心后，氯化铯会在离心场内沉降，形成稳定的连续梯度。与此同时，生物大分子会向相当于其自身浮力密度的某个位置移动，形成一条狭窄的带。

b.蔗糖

蔗糖因其价格低廉、溶解度高而被普遍采用，但高浓度蔗糖黏度大、渗透压高，不适于分离对渗透压敏感的细胞器。

c.Ficoll

Ficoll是蔗糖的多聚体，中性，平均分子量400000，当密度为1.2g/mL，未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜，适于已知密度细胞的分离，如PBMC。

d.Percoll

Percoll是一种PVP涂层的硅胶颗粒介质，扩散常数低，所形成的梯度十分稳定，渗透压很低，粘性也很小，不穿透生物膜，对细胞无毒害。Percoll PLUS是共价偶联烷硅涂层硅胶介质，性质更加稳定；Percoll PLUS内毒素含量较低(<2EU/ml)，可以用于临床研究，Percoll仅能用于科研。

Percoll的硅胶颗粒大小不一，在离心过程中可迅速形成连续密度梯度区，是高浓度蔗糖的较好替代品，但缺点是较难去除。应用范围较广，不仅仅适于分离不同密度的细胞，还可分离亚细胞器和病毒，可实现从1.02-1.3g/ml范围内的密度梯度离心分离。

④具体应用

a.Ficoll密度梯度离心法分离PBMC

外周血单个核细胞(PBMC)，是指外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞和其他少量细胞。单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其它细胞不同，红细胞和多核白细胞的比重超过1.080，单个核细胞的比重为1.070左右，血小板为1.030左右。

利用Ficoll作密度梯度离心时，各血液成分将按密度梯度重新分布聚集：血浆和血小板密度较低，悬浮于分离液的上部；红细胞与粒细胞密度较大，沉于分离液的底部；PBMC密度稍低于分离液，位于分离液界面之上，移去上层组分就可获得PBMC。

b.Percoll密度梯度离心法分离BMSC

BMSC，骨髓间充质干细胞，利用Percoll作密度梯度离心时，红细胞及多核细胞因比重(1.080g/mL) 较大而沉降于底部，其次是单个核细胞（包括BMSCs、造血干细胞、单核细胞等），悬浮密度位于(1.056-1.075) g/mL，血浆及其溶解物悬浮密度位于1.050g/mL。

整个梯度离心要求慢升慢降，需要在离心机里设置加速度，一般有1到9级可选。Percoll升降都要3的加速度; Ficoll升速时没有要求，降速时要慢，建议关闭刹车，设置加速度为3。

3、细胞电泳

在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动，这种现象称为细胞电泳。引起细胞电泳的电位值称为ξ电位，各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。

在恒定的电场条件下，同种细胞的电泳速度相当稳定，因而可通过测定电泳速度来推算出细胞的ξ电位。ξ电位常因细胞生理状态和病理状态而异，因此在诊断疾病上有一定价值。此外由于不同类型的细胞在电场中的泳动速度不同，细胞电泳可用来分离不同种类的细胞，例如可把淋巴细胞与造血细胞分开。

三、基于生化亲和力的细胞分选技术

单克隆抗体的特异性和多样性使利用不同抗体的合理组合分离不同类型的细胞成为可能。目前，抗体介导的细胞分离技术主要有抗体/补体介导的细胞溶解法，流式细胞仪细胞分选法，平面黏附分离法，免疫磁珠分离法等。

1、免疫溶解法

当补体存在时，用抗细胞某一表面标志的特异性抗体与异质性细胞一起孵育，可以是具有该特异性表面标志的细胞溶解。

利用这一原理，可将消除细胞的特异性表面标志的抗体和补体加入细胞培养物中，使抗体及补体作用于具有相应抗原的细胞并溶解之，而对该抗原阴性的细胞进行富集。

2、流式细胞分选术

利用一个或数个荧光基团标记的抗体与细胞孵育以进行标记，标记好的细胞悬液放入样品管中，被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。

将这些液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。

3、免疫磁珠分选法

免疫磁珠分选法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合的原理。在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。

免疫磁珠分选法分为正选法和负选法。在正选法中，磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞；而在负选法中，磁珠结合不需要的细胞，游离于上清液的细胞即为所需目的细胞。

4、选择性的细胞凝集/形成玫瑰花结

羟乙基淀粉和甲基纤维素可以使红细胞形成大的'钱串'，加速其沉降，从而比其他细胞更快地从造血细胞悬液中沉降出去。这一方法通常用于快速去除大量成熟的红细胞,而不会对有核细胞群造成太大的损失。

血液或骨髓中的T细胞可以通过与绵羊红细胞发生凝集而除去，凝集的形成是由于T细胞表面的CD2分子和绵羊红细胞上特异的配体相互作用的结果，形成玫瑰花结的细胞与没有形成玫瑰花结的细胞通过密度梯度离心即可分开。

参考文献：

［1］细胞分离技术-百度百科

［2］干细胞分离:密度梯度离心法、免疫磁珠分选法和流式细胞仪分离法-赛业广州生物

［3］Percoll 、Ficoll 深度详解，让你的细胞分离不再难-优宁维生物

［4］细胞分离纯化的几项常用技术_中科博生