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研究介绍✦ · 研究背景 Background 癌症是当今世界面临的主要健康问题之一。微卫星不稳定型(MSI)癌症是一类特殊的癌症亚型，因错配修复基因缺陷而导致的微卫星序列异常。尽管免疫检查点抑制剂治疗取得了一定成果，但MSI癌症患者仍有较大的未满足医疗需求。最近的多个遗传筛选研究发现，在MSI癌细胞中，Werner综合征ATP依赖性DNA解旋酶(WRN)是一个潜在的合成致死靶点。 研究目的 Objectives 本研究旨在开发一种临床阶段的WRN解旋酶抑制剂HRO761，并对其进行全面的结构、生物化学、细胞和药理学特性研究，探索其作为MSI癌症治疗新策略的潜力。 研究方法✦·多元技术对HRO761全面评估 1、通过ATP结合筛选和药物化学优化，发现了先导化合物并优化得到HRO761。 2、解析了HRO761与WRN解旋酶结构域的共晶结构，阐明了其独特的变构别构抑制机制。 3、系统评估了HRO761对WRN及其他RecQ家族解旋酶的生化抑制活性和选择性。 4、在多个MSI和MSS细胞系中研究了HRO761的抗增殖活性、DNA损伤和细胞周期阻滞效应，以及对WRN蛋白的影响。 5、利用CDX和PDX模型评估了HRO761的体内药效学、PK/PD特性和抗肿瘤疗效。 这些多维度的研究为阐明HRO761的作用机制和开发其临床应用潜力提供了关键依据。一个有趣的发现是，HRO761可以诱导MSI肿瘤细胞中WRN蛋白的降解，但在正常细胞中没有这种效应。 研究发现✦·1、HRO761的发现与分子机制 研究人员最初使用WRN解旋酶测定(DNA解旋和ATP酶活性)进行筛选，只发现了共价抑制剂，与之前其他WRN抑制剂筛选活动的结果类似。他们将这些抑制剂鉴定为变构别构、ATP竞争性抑制剂，其作用靶点为Cys727。为了找到酶活性筛选中未检测到的非共价弱抑制剂，研究人员开发了一种ATP结合测定方法。 通过这一创新筛选策略，研究人员从150,000个化合物的文库中筛选出了唯一的非共价结合hit化合物1 (图1a) 。随后采用基于结构的药物设计，并以**亲脂效率(lipophilic efficiency, lipE)**作为指标，对该化合物进行优化，得到了细胞水平活性很好但分子量较大的化合物2(图1b) 。 为了在提高化合物渗透性的同时降低亲脂性，研究人员采用基于物理的性质预测方法，系统搜索了离群值转化。最终得到的优化化合物HRO761在保持较大分子量(702 Da)的同时，具有良好的物理化学性质、DMPK特性和高选择性。 HRO761与WRN解旋酶核心结构域(包括两个RecA样解旋酶结构域D1和D2)形成的共晶体结构显示，HRO761结合在D1-D2界面上的一个非保守变构位点，解释了其相对于其他RecQ家族解旋酶的高选择性(图1c, d)。 有趣的是，与ATP类似物结合时相比，HRO761诱导D1和D2结构域发生约180°的相对旋转(图1c)，这是由D1和D2之间的一个灵活铰链区(728-732位氨基酸)的构象变化引起的。HRO761与这一铰链区有广泛的相互作用，几乎所有HRO761分子上的重原子都参与了与WRN的极性相互作用(图1d)。 这种独特的结合模式使HRO761竞争性地占据了ATP的部分结合位点，并通过变构诱导Walker基序移位，从而阻断ATP结合和水解(图1e)。然而，HRO761并不影响DNA底物与WRN的结合。
图1. HRO761的鉴定和作为变构WRN抑制剂的结构基础 a. 高通量筛选流程及筛选标准，最终筛选出hit化合物1。b. hit化合物1的结构及基于结构活性关系和理化性质优化得到临床候选药物HRO761 (化合物4)。c. 晶体结构显示HRO761以新颖构象结合WRN解旋酶的D1-D2结构域界面，起变构别构抑制作用。d. HRO761与D2结构域ATP结合位点部分重叠，其结合位点特异性强，含有丰富的精氨酸残基。e. 与ATPγS结合状态相比，HRO761诱导D2结构域发生构象变化，取代并拟态ATP γ-磷酸，改变Walker基序构象。 在HRO761诱导的这种构象中，WRN的C末端从游离状态下的α螺旋构象转变为类似RNase A的β折叠构象(图2, 右)，催化位点完全暴露，H13和H114两个关键催化残基的构象与RNase A中的一致，可以很好地催化RNA底物水解(图2a, c)。这种C末端构象的重排是由其与18S rRNA h30、β5/6等多个元件的相互作用引起和稳定的(图2d)。 综上，这些结果表明HRO761以一种独特的变构机制特异性抑制WRN，并通过稳定无活性构象而发挥强效的催化抑制作用。这为高选择性和高效的WRN抑制剂的理性设计提供了重要结构基础。 2、WRN抑制剂在MSI细胞中选择性诱导
图2. WRN抑制剂在MSI细胞中选择性诱导DNA损伤和细胞周期阻滞 a. HRO761对MSI细胞SW48和MSS细胞CAL33的4天处理剂量-存活率曲线。b. HRO761在MSI和MSS细胞株中的CFA GI50与DRIVE数据库中WRN依赖性评分的相关性。c. HRO761在MSI和MSS细胞中的CellTiter-Glo GI50和PS50(蛋白稳定化IC50)的相关性。C727突变减弱HRO761与WRN的结合。d，e. HRO761在MSI细胞中选择性诱导DNA损伤反应，WRN降解及染色质结合。f. 蛋白质组学证实HRO761在MSI细胞中特异性降解WRN。g. HRO761诱导的WRN降解依赖于细胞背景，拓扑异构酶抑制剂诱导的WRN降解为普遍现象。h. 基因表达分析显示HRO761在MSI细胞中激活p53通路。 为了系统评估HRO761的细胞活性，研究人员在20个MSI和8个MSS细胞系中测试了其抗增殖活性。结果发现，HRO761在纳摩尔浓度(IC50 50-1000 nM)下选择性抑制MSI细胞系的克隆形成，但即使在10 μM高浓度处理10-14天也不影响MSS细胞系(图2b)。HRO761的敏感性与细胞内WRN的依赖性(DRIVE score)相关。 然而，HRO761与WRN的结合在所有检测的MSI和MSS细胞系中都是相似的，其蛋白稳定化IC50(PS50)在10-100 nM范围内(图2c)。敲入C727A或C727S突变降低了HRO761与WRN的结合，同时削弱了其细胞增殖抑制和PD效应(图2c)。这些结果说明，尽管HRO761在所有细胞中都能有效结合WRN，但只在MSI细胞中抑制WRN才产生选择性的细胞毒性。 在对HRO761敏感的MSI细胞系中，观察到HRO761处理诱导DNA损伤反应，包括ATM、CHK2激酶磷酸化，p53激活和γH2AX фокі增加，而在HRO761不敏感的细胞系中未见此反应(图2d)。有趣的是，HRO761诱导WRN降解和染色质结合增加也只在MSI细胞中观察到(图2e)。蛋白质组学分析证实，WRN是HRO761处理后在3个MSI细胞系(而非MSS细胞系)中丰度下降最显著的蛋白(图2f)。 进一步研究表明，HRO761诱导的WRN降解发生在蛋白水平且依赖于蛋白酶体。虽然拓扑异构酶抑制剂如喜树碱和依托泊苷也能诱导WRN降解，但这是普遍现象，而非MSI细胞特异的(图2g)。相比之下，WRN敲除对HRO761诱导的DNA损伤反应没有明显影响，提示WRN功能丧失是HRO761诱导DNA损伤和随后WRN降解的上游事件。 RNA测序分析显示，HRO761在4个MSI细胞系中显著调控了多个基因的表达，包括CDKN1A、MDM2等p53靶基因，而在MSS细胞和WRN敲除细胞中没有观察到基因表达变化(图2h)。小鼠移植瘤研究也证实了p53通路在体内被HRO761激活。 更详细的分析表明，HRO761处理后1小时内即诱导ATM和CHK2激活，8小时后WRN降解明显，24小时时p21表达上调并引起G2/M期阻滞(图3a-e)。这些结果提示WRN降解可能是DNA损伤反应激活的下游事件，而非细胞周期阻滞的原因。此外，虽然DNA损伤反应通常伴随有CHK1激活和S期阻滞，但HRO761主要诱导G2/M期阻滞，这可能与MSI细胞中CHK2水平下调有关(图3a)。 最后，研究人员分析了HRO761的抗肿瘤活性与p53状态的关系。基于DRIVE数据的重新分析表明，无论p53状态如何，MSI细胞均依赖WRN。体外实验证实，HRO761在HCT116 p53野生型和敲除细胞中的IC50相似(图3f)，但在后者中未见p21等p53靶基因的诱导(图3g, h)。然而，ATM/CHK2激活和WRN降解在两种细胞中都能被HRO761诱导(图3g)。这些结果在另外两个p53突变的MSI细胞系中得到了进一步验证。
图3. WRN抑制剂以时间和剂量依赖的方式诱导细胞周期阻滞和DNA损伤，与p53无关 综上所述，通过在细胞水平和分子水平的系统研究，阐明了HRO761选择性杀伤MSI细胞的作用机制，即选择性诱导持续的DNA损伤反应，并引起细胞周期阻滞和凋亡。这一过程不依赖于p53，而主要由ATM-CHK2通路驱动，并伴随有WRN的泛素化降解。这些发现突显了HRO761作为精准治疗MSI肿瘤的巨大潜力。 3、HRO761在动物模型中的药效学评估 为了评估HRO761作为临床候选药物的潜力，研究人员系统分析了其在多个CDX和PDX肿瘤模型中的药代动力学、药效学和抗肿瘤疗效。在SW48结肠癌CDX模型中，HRO761表现出良好的口服药代动力学特性，在20-120 mg/kg剂量范围内的暴露量与剂量成正比，连续给药92天未见明显蓄积(图4a, b)。从抗肿瘤疗效来看，HRO761在20 mg/kg即可使肿瘤生长静止，60-120 mg/kg剂量下可诱导75-89%的肿瘤消退，维持缓解长达60天(图4a)。重要的是，HRO761的血药浓度与疗效密切相关，其游离血药浓度时间曲线(AUC)高于细胞水平IC90的时间与肿瘤生长抑制率成正比(图4b)。 PD标志物分析显示，HRO761在体内有效抑制WRN，诱导DNA损伤反应(pKAP1增加)并激活p53通路(p21诱导)，这些变化在60 mg/kg剂量下于给药后第8天达到稳态，并随肿瘤消退而逐渐减弱(图4c)。组织学分析也证实，HRO761剂量依赖性地抑制肿瘤细胞增殖(Ki67阳性)，并引起细胞核增大，提示有丝分裂灾变(图4d)。 在一项包括结直肠癌、卵巢癌、胃癌和子宫内膜癌等多个适应症在内的大型PDX和CDX药效筛选中，HRO761展现出广谱的抗肿瘤活性，总体疾病控制率约70%，其中35%为疾病稳定，30%为部分缓解，9%为完全缓解(图4e)。值得一提的是，在该项研究中观察到的2例完全缓解均为p53突变的肿瘤模型，再次印证了HRO761的p53非依赖性抗肿瘤机制。 最后，研究人员评估了HRO761与伊立替康联用的疗效。体外试验表明，HRO761与伊立替康在低于各自有效浓度时即可产生协同的细胞毒作用，并在高浓度HRO761处理下完全抑制了细胞再生长(图4f)。γH2AX分析证实，药物联用较单药可显著增加DNA双链断裂。 体内研究进一步证实，HRO761与伊立替康联用可在多个剂量组合下诱导肿瘤完全消退，且未见明显毒副作用(图4g)。这提示联合用药可能降低HRO761和伊立替康所需的个体给药剂量，从而拓宽治疗窗。
图4. HRO761在体内药效学验证了其针对MSI肿瘤的合成致死作用 总结与展望✦·MSI癌症患者 新的治疗选择 HRO761是首个进入临床开发的WRN抑制剂，对MSI癌症具有独特的合成致死作用，有望为MSI癌症患者提供新的治疗选择。目前HRO761正在开展I期临床试验，以评估其在结直肠癌等MSI实体瘤中的安全性和初步疗效。 未来研究 进一步探索HRO761的治疗方案 总的来说，这是一项出色的转化研究，揭示了WRN解旋酶抑制剂HRO761独特的作用机制，并在多个层面验证了其作为MSI癌症治疗新策略的潜力。未来还需进一步探索HRO761与其他治疗方式的最佳组合，以期最大化临床获益。同时，WRN降解的分子机制，以及HRO761耐药的可能机制也值得深入研究。 参考文献 [1] Ferretti, S., Hamon, J., de Kanter, R. et al. Discovery of WRN inhibitor HRO761 with synthetic lethality in MSI cancers. Nature 629, 443–449 (2024). https:///10.1038/s41586-024-07350-y END 文案 | 潘兴明 排版 | 夏小倩 审核 | 石利欣、夏小倩 发布｜姜笑南 世界生命科学大会 关注我们，获取生命科学 学界前沿｜促进更多的学术交流与合作 业界前沿｜促进更快的产品创新与应用 政策前沿｜促进更好的治理实践与发展 |
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