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大家好，今天跟大家分享一篇题为“Asymme tric CRISPR enabling cascade signal amplifi cation for nucleic acid detection bycom petitive crRNA”的文章，来自康涅狄格大学研究团队。在这篇研究工作中，作者开发了一种非对称CRISPR（asymmetric CRISPR）检测方法，利用竞争性crRNA的非对称反式剪切进行待测核酸的级联信号放大。 01 研究背景 由 CRISPR 技术提供支持的核酸检测为分子诊断提供了一种快速、灵敏和可部署的方法。虽然令人兴奋，但仍存在限制其实际应用的挑战，例如需要预扩增和缺乏定量能力。在这里，我们开发了一种不对称CRISPR检测方法，通过利用竞争性crRNA的不对称反式切割行为，用于核酸的级联信号扩增检测。 我们发现全尺寸 crRNA 和 CRISPR-Cas12a 分裂的 crRNA 之间的竞争反应可以诱导级联信号扩增，从而显着改善靶标检测信号。此外，我们发现CRISPR-Cas12a可以识别片段化的RNA/DNA靶标，从而能够通过Cas12a直接检测RNA。 基于这些发现，我们应用我们的不对称CRISPR检测法定量检测microRNA，无需预扩增，检测灵敏度为856 aM。此外，使用这种方法，我们分析和量化膀胱癌患者血浆样本中的miR-19a生物标志物。这种不对称的CRISPR检测具有广泛应用于各种诊断环境中简单灵敏的核酸检测的潜力。 见图一 常规CRISPR检测和非对称CRISPR检测的核酸示意图。  图一 a 通过单个全尺寸 crRNA 进行常规 CRISPR-Cas12a 测定的示意图。 b 使用两种竞争性 crRNA（全尺寸 crRNA 和分裂 crRNA）进行不对称 CRISPR 测定的工作原理。全尺寸 crRNA 对 Cas12a 具有更高的亲和力，并特异性结合靶核酸。分裂的crRNA被设计成与其自身的ssDNA序列（split-T）结合，该序列与靶核酸不同。由于两种crRNA与CRISPR的结合亲和力不同，CRISPR-Cas12a首先被全尺寸crRNA及其靶核酸激活，然后被分裂的crRNA及其分裂T重新激活，从而产生核酸检测的级联信号扩增。N.C.，阴性对照。插图是用 BioRender.com 创作的。 见图二 全尺寸crRNA和分裂的crRNA之间的竞争性CRISPR反应。  图二 a 竞争性 crRNA（全尺寸和分裂的 crRNA）对靶标 DNA 和靶标特异性 crRNA（全尺寸和分裂的 crRNA）的反式切割反应的影响。竞争性 crRNA 被设计为与靶标特异性 crRNA 不同的靶序列结合。插图是用 BioRender.com 创作的。 b Δ荧光强度（ΔFL;F靶DNA- 女控制）在存在不同浓度的竞争性crRNA（10、20、40和80 nM）的情况下进行靶标特异性crRNA反应。所有实验一式三份，图表用平均±标准差（S.D）表示。 c 电泳淌度位移测定。（左）Cy5-全尺寸crRNA的浓度固定在200 nM，FAM-split-crRNA的浓度从0到400 nM（0、50、100、200和400 nM）不等。即使分裂的crRNA浓度增加，Cy5全尺寸的crRNA仍与Cas12a结合。（右）FAM-split-crRNA的浓度固定在200 nM，Cy5全尺寸crRNA的浓度从0到400 nM（0、50、100、200和400 nM）不等。随着Cy5全尺寸crRNA浓度的增加，与Cas12a结合的FAM分裂crRNA被Cy5全尺寸crRNA取代。每个凝胶图像分别用Cy5和Alexa 488荧光滤光片测量，然后合并。红色条带代表Cy5荧光信号，绿色条带代表FAM荧光信号。这个实验进行了两次。源数据以源数据文件的形式提供。 见图三 竞争性crRNA检测核酸的级联信号扩增。  图三 a 将Cas12a、全尺寸crRNA和分裂的crRNA与Cy5-full-T和FAM-split-T的不同组合一起孵育0、5、15和30分钟。更多样化的控制条件如附图1所示。这个实验进行了两次。M = 标记物，[Cas12a] = 100 nM，[全尺寸 crRNA] = 40 nM，[split crRNA] = 10 nM，[Cy5-full-T] = 100 nM，[FAM-split-T] = 50 nM。 b 将Cas12a、Cy5-全尺寸crRNA和FAM-split crRNA与全T和分裂T的不同组合孵育0和30分钟。5'-Cy5-全尺寸crRNA在5'端被LbCas12a修剪（第一个Cy5偶联尿嘧啶被切割）。17更多样化的控制条件如附图2所示。这个实验进行了两次。M = 标记物，[Cas12a] = 200 nM，[Cy5 全尺寸 crRNA、FAM 分裂 crRNA 手柄和分裂 crRNA 间隔区] = 100 nM，[全 T] = 100 nM，[split-T] = 50 nM。 使用片段核酸靶标对Cas12a进行RNA检测的比较和优化。c 电泳淌度位移测定。在没有全T（左）或存在非靶标（中）的情况下，全尺寸crRNA抑制与Cas12a的分裂crRNA结合。在全尺寸的crRNA/Cas12a被全T激活后，分裂的crRNA可以取代全尺寸的crRNA-DNA杂交体或Cas12a中切割的R环（右）。这个实验进行了两次。[LbCas12a] = 250 nM，[Cy5-全尺寸 crRNA] = 200 nM，[Full-T] = 100 nM，[非靶标] = 100 nM。分别用 Cy5 和 Alexa488 滤光片测量凝胶，然后合并。红色波段表示 Cy5 信号，绿色波段表示 FAM/SYBR 金信号。源数据以源数据文件的形式提供。 见图四 SPRY1在CD8+T细胞中的表达增加了Tpex的比例并促进了对抗PD-1治疗的反应对抗肿瘤。  图四 a Cas12a/crRNA 复合物结合两个片段化的单链核酸靶标（分别为黑-红和红-蓝，红色表示 crRNA 结合区域）的示意图，导致反式切割反应的激活。如果仅存在一个片段靶标，则不能诱导反式裂解反应。插图是用 BioRender.com 创作的。 b-d：DNA激活因子和片段核酸靶标的序列（上图b-d，红色表示crRNA结合区），以及不同条件下相应的荧光信号（b-d、N.C、激活因子、靶标以及激活因子和靶标的混合物）。测试了用 DD crRNA 制成的 Cas12a 核糖核蛋白复合物的 b 和 d，测试了用 RD crRNA 制成的 c。所有实验一式三份，图表用平均值（粗线）±标准差（S.D）表示。[Cas12a] = 100 nM，[DD 和 RD crRNA] = 10 nM，[DNA 激活因子] = 100 nM，[DNA 靶标] = 100 nM，[RNA 靶标] = 100 nM。源数据以源数据文件的形式提供。 见图五 通过非对称CRISPR测定法进行miRNA定量检测。  图五 a 基于非对称CRISPR检测的miRNA检测示意图。插图是用 BioRender.com 创作的。 b Δ荧光强度（F靶 miRNA– 女控制）取决于10至60nM的全尺寸crRNA浓度。[Cas12a] = 100 nM，[分裂 crRNA] = 10 nM，[DNA 激活剂] = 20 nM。（n = 3，数据表示为三个技术重复的平均值± S.D）。 c Δ 荧光强度取决于 10 至 80 nM 的分裂 crRNA 浓度。[Cas12a] = 100 nM，[RD crRNA] = 40 nM，[DNA 激活剂] = 20 nM。（n = 3，数据表示为三个技术重复的平均值± S.D）。 d Δ荧光强度取决于10至80 nM的DNA激活剂浓度。[Cas12a] = 100 nM，[分裂 crRNA] = 10 nM，[RD crRNA] = 40 nM。（n = 3，数据表示为三个技术重复的平均值± S.D）。 e Δ荧光强度取决于25至200 nM的Cas12a浓度。[分裂的crRNA] = 10 nM，[RD crRNA] = 40 nM，[DNA 激活剂] = 20 nM。（n = 3，数据表示为三个技术重复的平均值± S.D）以miR-19a序列为靶标，浓度为10 pM。 f 不对称CRISPR测定（红色）和Cas12a/crRNA反应（黑色）的瞬态荧光信号变化。插图是 Δ 荧光强度 （F靶 miRNA– 女控制）非对称CRISPR测定（红色）和Cas12a/crRNA反应（黑色）的比较。目标 miR-19a 浓度为 1 pM。每条曲线均由控制信号减去。（n = 7，数据表示 7 个技术重复的平均 ± S.D）。 g 不对称 CRISPR 测定（红色）和 Cas12a/crRNA（黑色）的 Δ 荧光强度与靶 miRNA 浓度的关系。插图是荧光信号与 miR-19a 对数浓度之间的线性关系，范围为 1 fM 至 10 pM。（n = 7，数据表示 7 个技术重复的平均值 ± S.D）。 h， i 不同类型miRNA（miR-19a、let-7a、miR-21、miR-155和miR-122）的瞬态荧光信号和Δ荧光强度。[miR-19a] = 100 pM，[let-7a、miR-21、miR-155 和 miR-122] = 1 nM。（n = 3，数据表示为三个技术重复的平均值± S.D） 源数据以源数据文件的形式提供。 见图六 非对称CRISPR检测在临床样本中无扩增miRNA检测的临床应用。  图六 a 使用不对称CRISPR测定法检测人血浆样品中miRNA的示意图。插图是用 BioRender.com 创作的。 b 膀胱患者血浆样本（样本 1-10）和健康供体血浆样本（样本 11-15）中的估计目标 miR-19a 浓度。蓝色虚线表示健康供体的最高目标 miRNA 浓度加上标准差。（n = 3，数据表示为三个技术重复的平均值± S.D。 c 不对称 CRISPR 测定和常规 RT-qPCR 测定的估计目标 miR-19a 浓度的热图。通过不对称CRISPR（红色）和RT-qPCR（黑色）在膀胱患者和健康供体中分析miR-19a表达水平。中心线表示表达水平的中位数，框的边界表示四分位距，晶须表示最大值和最小值。源数据以源数据文件的形式提供。 02 研究结论 总之，我们在这项研究中看到了两个主要的CRISPR发现：（i）全尺寸crRNA和分裂的crRNA之间的竞争反应可以提高CRISPR-Cas12a的检测灵敏度（图1）。2 和 3），以及 （ii） Cas12a 可以识别与 crRNA 互补的片段 RNA/DNA 靶标，从而能够直接检测 RNA（图 2 和 3）。基于这些发现，我们开发了一种用于核酸级联信号扩增检测的不对称CRISPR检测方法，并将其应用于临床癌症样本中的miRNA定量检测，而无需预扩增或逆转录。 好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。 |
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