【原】人类小气道上皮(SAE)特异性细胞分析

文章概述

文章标题：《Cell-specific expression of lung disease risk-related genes in the human small airway epithelium》

发表日期和杂志：2020年发表在Respiratory Research上

在线阅读链接：https:///10.1186/s12931-020-01442-9

小气道上皮(SAE)简介

小气道上皮(SAE)是覆盖第6 -23代分支气道的单层细胞，在大多数肺部疾病的发病早期事件中起着核心作用，包括遗传性肺部疾病、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、特发性肺纤维化（IPF）和肺癌

人类SAE由5种主要细胞类型组成，包括基底细胞（BC）、中间细胞、纤毛细胞、产粘液细胞和俱乐部细胞。SAE还含有少量罕见的上皮和炎症/免疫细胞

单细胞实验设计

对3名健康的非吸烟者和3名无症状吸烟者采用威尔康奈尔医学院机构审查委员会批准的临床方案进行评估，并通过支气管镜刷收集小气道上皮(第10 -12代支气管)。对11702个单细胞样本进行单细胞捕获和Drop-seq单细胞rna测序。

单细胞转录组数据情况

数据链接是：https://www.ncbi.nlm./geo/query/acc.cgi?acc=GSE123405

GSM3502715 DGM-13427_sm (DropSeq_SingleCell_demographics)
GSM3502716 DGM-13460_sm (DropSeq_SingleCell_demographics)
GSM3502717 DGM-13451_sm (DropSeq_SingleCell_demographics)
GSM3502718 DGM-00384_sm (DropSeq_SingleCell_demographics)
GSM3502719 DGM-13434_sm (DropSeq_SingleCell_demographics)
GSM3502720 DGM-13471_sm (DropSeq_SingleCell_demographics)

数据详情：

GSM3502715_DGM-13427_sm_sc.txt.gz 3.0 Mb
GSM3502716_DGM-13460_sm_sc.txt.gz 4.7 Mb
GSM3502717_DGM-13451_sm_sc.txt.gz 3.7 Mb
GSM3502718_DGM-00384_sm_sc.txt.gz 7.8 Mb
GSM3502719_DGM-13434_sm_sc.txt.gz 4.6 Mb
GSM3502720_DGM-13471_sm_sc.txt.gz 5.5 Mb

提供的是txt.gz格式的文件，所以使用fread函数读取即可

dir='GSE123405_RAW/' 
samples=list.files( dir )
samples
sceList = lapply(samples,function(pro){ 
  # pro=samples[1] 
  print(pro)  
  ct=fread(file.path( dir ,pro),data.table = F)
  ct[1:4,1:4]
  rownames(ct)=ct[,1]
  colnames(ct) = paste(gsub('_CountMatrix.txt.gz','',pro),
                       colnames(ct) ,sep = '_')
  ct=ct[,-1] 
  sce =CreateSeuratObject(counts =  ct ,
                          project =  pro  ,
                          min.cells = 5,
                          min.features = 300 )
  return(sce)
}) 


do.call(rbind,lapply(sceList, dim))

sce.all=merge(x=sceList[[1]],
              y=sceList[ -1 ],
              add.cell.ids = samples  ) 

names(sce.all@assays$RNA@layers)
sce.all[["RNA"]]$counts 
# Alternate accessor function with the same result
LayerData(sce.all, assay = "RNA", layer = "counts")
sce.all <- JoinLayers(sce.all)
dim(sce.all[["RNA"]]$counts )

文章主要分析结果简介

非吸烟者的单细胞分析

对来自3名非吸烟者的4275个单细胞进行了测序和分析，通过t-SNE聚类鉴定出11个独特的细胞群

1. 基底细胞（BC）：高表达KRT5、KRT15和TP63；
2. 中间细胞：高表达BC（KRT5、KRT15、TP63）和club细胞（SCGB1A1、CYP2F1）标记物；
3. club细胞：高表达SCGB1A1和CYP2F1；
4. 产粘液细胞：高表达MUC5AC；
5. 纤毛细胞：高表达FOXJ1；
6. 离子细胞：高表达FOXI1；
7. 神经内分泌细胞：高表达CHGA；
8. T细胞：高表达CD3D；
9. 抗原呈递细胞：高表达主要组织相容性复合体（MHC），包括HLA-DRA；
10. 肥大细胞：高表达KIT；
11. NCL高表达细胞：高表达NCL，一个编码核仁蛋白的基因

根据分析结果发现，基底细胞的数量经常超过纤毛细胞的数量，这表明小而圆的基底细胞比大而长的纤毛细胞更能忍受细胞处理过程。

对主要上皮细胞群的特征基因进行了可视化，

单细胞rna测序也揭示了人类SAE中次要细胞群，发现SAE中存在离子细胞——在小鼠气道和人大气道上皮(LAE)中发现的一种罕见的细胞群

在人类SAE中，离子细胞的功能与离子转运、吞噬体酸化和胰岛素受体信号传导有关

SAE中还含有少量神经内分泌细胞——人类气道中的特化上皮细胞，它们高度表达微管蛋白（TUBA4A, TUBA1A）和神经内分泌介质（RTN1, CHGA）

除了上皮细胞群体，人类SAE还包含炎症/免疫细胞，包括表达多种细胞表面分子（CD2, CD3, MHC I类分子）和细胞因子（CCL5, IL32）的T细胞，还存在在过敏反应中发挥中心作用的肥大细胞

肺部疾病风险相关的基因表达分析

文章评估了与单基因肺疾病、COPD、IPF和肺癌风险相关的单细胞基因表达数据

1. 单基因肺疾病相关基因

对健康个体的SAE进行的单细胞RNA测序显示，当突变时会导致单基因肺疾病的基因表达

CFTR（导致囊性纤维化（CF）的致病基因）在气道上皮细胞中广泛表达，比如会在club细胞以及中间细胞和粘液细胞中广泛分布

2. 慢性阻塞性肺病（COPD）相关基因

通过全基因组关联研究（GWAS）/外显子芯片或相关表型识别的COPD风险基因被分为确定性（16个基因）和可能性（10个基因）

在多种SAE细胞群体中检测到12个确定性COPD风险基因和8个可能性COPD风险基因

大多数COPD基因在SAE细胞群体的非常小的子集中表达，除了DSP基因，该基因锚定中间丝，在大约60%的主要分化上皮细胞和离子细胞中表达

3. 特发性肺纤维化（IPF）相关基因

全基因组关联研究（GWAS）已经确定肺泡表面活性物质、端粒长度和炎症基因可能涉及IPF的风险。

对SAE单细胞数据中，与端粒长度相关的基因DKC1和PARN在主要上皮细胞群体的子集以及一些免疫细胞中表达

IPF基因DSP和FAM13A也与COPD风险增加相关，这表明这两种疾病之间存在关联。

4. 肺癌相关基因

大多数导致肺癌的“驱动”基因的突变位于基因的编码序列中,对非吸烟者的SAE进行的单细胞分析显示了人类SAE中潜在的（如果发生突变）肺癌驱动基因的细胞特异性表达。

• EGFR在10%至35%的非小细胞肺癌（NSCLC）中发生突变，在基底细胞（BC）、中间细胞中富集，在离子细胞中表达水平更高。
• KRAS是导致10%至30%肺腺癌的致癌基因，在神经内分泌细胞中高度表达。
• MET在NSCLC中发生突变，是中间细胞和俱乐部细胞的特征性基因。
• TP53是肺癌中最常发生突变的基因，而RB1是小细胞肺癌中一个定义明确的突变基因，它们分别在NCL高细胞和肥大细胞的子集中表达。

吸烟者的单细胞分析

吸烟改变了特定小气道上皮细胞（SAE）群体的转录组，对3名吸烟者的6977个人类SAE单细胞进行了测序、分析，并与非吸烟者的单细胞进行了比较。

在吸烟者中识别出十个细胞群体，将它们映射到非吸烟者中的细胞群体。

与非吸烟者相比,吸烟者中club细胞的比例显著减少，而基底细胞（BC）、粘液产生细胞和肥大细胞的比例增加，这与吸烟相关的人类气道形态学变化一致。

比较非吸烟者与吸烟者每个细胞群体的转录组，吸烟显著改变了主要上皮细胞群体的转录组，而在离子细胞和免疫细胞中的影响较小。

与防御毒素（例如，ALDH3A1, CYP1B1）和防御病原体及颗粒物（例如，SCGB1A1, LTF）相关的基因在吸烟者的上皮细胞群体中分别上调和下调。

一些新的防御基因在特定细胞群体中的调节失调，例如，CXCL6（中性粒细胞的化学吸引剂）和ALCAM（免疫球蛋白超家族的成员）在吸烟者的俱乐部细胞和纤毛细胞中分别下调，表明吸烟者SAE中的宿主防御丧失在不同细胞类型中是不均匀的。

文章小结

• 识别出11种不同的细胞群体，包括主要的和稀有的上皮细胞，以及免疫/炎症细胞。
• 存在与遗传性肺疾病风险相关的基因的细胞类型特异性表达，与慢性阻塞性肺病（COPD）和特发性肺纤维化（IPF）风险相关的基因，以及（未突变的）肺癌驱动基因。
• 香烟烟雾显著改变了细胞类型特异性转录组和与疾病风险相关的基因。