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肠道氨基酸的微生物代谢影响宿主营养平衡和生理 Microbiota metabolism of intestinal amino acids impacts host nutrient homeostasis and physiology  Article, 2023-04-23, Cell Host & Microbe, [IF 30.3] 原文链接：https:///10.1016/j.chom.2024.04.004 第一作者：Ting-Ting Li 通讯作者：Chun-Jun Guo 主要单位： Jill Roberts Institute for Research in Inflammatory Bowel Disease, Weill Cornell Medicine, Cornell University, New York, NY 10021, USA - 摘要 - 氨基酸（aa）稳态对人类健康和疾病至关重要。氨基酸稳态紊乱与疾病进展和病理恶化密切相关（Ⅱ型糖尿病或炎症性肠病 [IBD] 等）并且通常是治疗结果的决定因素。之前的代谢组学文献主要通过比较无菌（GF）小鼠与特定病原体缺失（SPF）小鼠的代谢图谱，已证明肠道细菌定植会影响胃肠道（GI）中游离氨基酸的分布，表明肠道微生物可能调节宿主体内氨基酸的生物利用度。 肠道微生物可能通过多种机制调节宿主氨基酸的可用性。例如，肠道细菌定植可能会影响肠道中的胰蛋白酶等蛋白质消化酶。肠道微生物定植还可能改变肠道通透性，从而影响胃肠道中游离氨基酸的运输和吸收。此外，肠道微生物可能会直接影响肠道菌群的迁移和吸收。在肠道中利用/代谢氨基酸或合成并向宿主提供氨基酸。先前的研究表明，肠道微生物组的变化（或存在）可能会影响肠道氨基酸谱。尽管如此，微生物的特性及其参与调节宿主氨基酸稳态的代谢基因在很大程度上并不清楚。关于微生物对宿主氨基酸稳态的调节如何影响宿主生理（或疾病）状态的信息也很少，因为没有有效的方法来精确操纵宿主定植背景下肠道氨基酸的微生物代谢。 在该研究中，我们发现肠道菌群通过代谢肠道氨基酸来主动重塑宿主氨基酸平衡：肠道微生物高效利用相对较大比例的肠道氨基酸，从而减少宿主组织和器官（胃肠道、肝脏等）对氨基酸的吸收和利用。优先鉴定参与肠道氨基酸代谢的微生物和代谢基因，原因有二：首先，肠道氨基酸的微生物利用是一种生理相关的代谢功能。患Ⅱ型糖尿病和其他疾病的患者通常存在氨基酸代谢失调。微生物对肠道氨基酸的利用可能会显着影响宿主氨基酸的可用性，从而可能调节Ⅱ型糖尿病等疾病的发生和发展。其次，由于这是微生物编码的代谢功能，破坏微生物群的组成和稳定性可能会往不利方向改变这种代谢活动并导致疾病发生。刻画相应的肠道微生物和代谢基因将为氨基酸-微生物群-宿主生物学相互作用提供更多分子层面的见解，并为监测和调节这种微生物群代谢活动以改善人类健康奠定基础。 在本工作中我们对参与肠道氨基酸代谢的肠道微生物和代谢基因进行刻画，并证明了这种微生物编码的代谢活动在调节宿主营养稳态和生理学中的功能作用。鉴于肠道微生物定植通常会减少肠道宿主和循环氨基酸，我们开发了一种体外基于活细胞的代谢组学检测方法，结合无菌小鼠模型来鉴定参与利用肠道氨基酸的候选肠道微生物。我们还发现复杂的人类微生物组表现出不同水平的肠道氨基酸代谢，并且活性水平与粪便氨基酸浓度密切相关。在基因水平上，我们基于CRISPR等遗传操作方法对系统发育多样化的肠道微生物的基因操作鉴定出多个可能负责肠道氨基酸代谢的代谢基因。为了研究它们在宿主定植背景下的代谢和生理影响，我们使用“还原论”方法，通过野生型对照和单个氨基酸代谢基因缺陷的突变株对无菌小鼠进行单一定植。这些工作表明，一些微生物编码的氨基酸代谢基因在调节宿主肠道和血液氨基酸的可用性方面发挥着重要作用。最后，我们发现支链氨基酸（BCAA）和色氨酸（Trp）代谢的微生物基因通过外周血清素影响宿主葡萄糖稳态。总之，我们的研究结果揭示了肠道微生物与宿主之间生理上重要的相互作用，以及在宿主营养稳态中发挥调节作用。 - 结果 - 鉴定参与肠道氨基酸代谢的肠道微生物 作者认为，如果肠道微生物能够快速消耗氨基酸，那么肠道微生物就会影响宿主肠道的氨基酸库。为了识别有效代谢肠道氨基酸的候选微生物，我们首先开发了一种体外、高通量、基于活细胞的代谢组学测定，以评估肠道微生物消耗氨基酸的效率（“相对速度”）。开发这样的实验流程时考虑了几个因素： 首先，肠道微生物之间的生长差异可能会影响它们的代谢基因表达和氨基酸代谢。我们绘制了所有待筛选肠道微生物的生长曲线，并进行参数拟合以估计其生长参数，如生长速率、滞后期等（表S1）。这项工作将使我们能够在可比较的生长阶段筛选这些肠道微生物。其次，对于给定的微生物，不同的生长阶段（如对数期或稳定期）也可能影响其对氨基酸的利用。因此，在初步筛选中，我们评估了它们在两个不同生长阶段的氨基酸利用率，包括对数中期和后期稳定期（图1A和S2）。第三，通过量化有限时间内氨基酸被降解的百分比来计算每种细菌的氨基酸消耗效率。为了相对更准确地估计个体肠道微生物利用特定氨基酸的速度，我们评估了添加氨基酸混合物后在不同时间点（15、30和60分钟）消耗的氨基酸比例（图S2）。最后，维生素、氮和碳源等其他营养物质也可能影响氨基酸的微生物代谢。例如，维生素B12的缺乏会阻止一些肠道细菌合成蛋氨酸（Met），可能会导致环境蛋氨酸的快速消耗。因此，除了氨基酸外，我们还在检测缓冲液中添加了无机氮源、微量矿物质补充剂、维生素补充剂和其他碳/能源，如葡萄糖（图1A；配方参见表S2）。通过这种方式，肠道微生物不太可能由于营养缺陷而迅速消耗氨基酸。  图1 鉴定参与高效利用氨基酸的肠道微生物 A：体外基于活细胞的代谢组学流程的示意图设计和优化，以确定有效消耗氨基酸的候选微生物。首先通过使用四种不同条件（参见STAR方法了解详细信息）筛选20种肠道微生物（在B中突出显示）来优化流程，并采用条件4对从健康人类粪便中分离出的104种肠道共生菌（跨越多个门）进行了大规模筛选。 B：本研究筛选的104种微生物的16S rRNA序列的系统发育树（按门着色）。数字对应于表S1中的菌株号。表S1提供了有关其生长的详细信息。用于流程优化的20种微生物用黄点突出显示。 C：高效His和Pro代谢菌C. senegalense和C. sporogenes与非代谢菌C. hathewayi的代表性LC-MS迹线。 D：C. sporogenes和C. senegalense在体外快速消耗His和Pro。通过测量不同时间点测定缓冲液中消耗的相应氨基酸的百分比来评估它们的消耗效率（显示了15、30和60分钟的数据）。 E：104种人类肠道共生菌的LC-MS筛选热图（热图原始数据见表S3）。通过平均联动层次聚类对热图进行聚类，并计算欧氏距离。如果单个肠道共生菌能够在体外代谢相应的氨基酸，则每种氨基酸的消耗效率用绿色表示；如果它们合成，则用粉红色表示。我们通过量化不同时间点（15、30和60分钟）测定缓冲液中消耗的相应氨基酸的百分比来评估其消耗效率。值“1”表示此时100%氨基酸被代谢（或剩余氨基酸低于LC-MS的检测限）。负值表明与缓冲液对照（不含微生物细胞）相比，在测定缓冲液中检测到更高浓度的相应氨基酸。热图显示了两次独立实验在60分钟时计算出的平均值。热图上标出了代表性菌株，包括Blautia hydronotropicica、B. ovatus、C. hathewayi、C. senegalense和C. sporogenes。在氨基酸分组图注中，“Aliphatic chain”代表脂肪族氨基酸，包括Ala、Val、Leu和Ile。“Aromatic”表示芳香族氨基酸，包括Phe、Tyr和Trp。“Amide”表示具有酰胺基的氨基酸，包括Asn和Gln。“Positively charged”代表pH = 7时带正电的物质，包括Lys、His和Arg。“Negatively charged”代表在pH = 7时带负电的氨基酸，包括Glu和Asp。“Hydroxyl”代表具有羟基官能团的氨基酸，包括Ser和Thr。“Sulfur”代表含硫氨基酸，包括Hcy、Cys和Met。 我们首先通过在四种不同条件下筛选20种肠道共生菌来优化我们的测定条件（图1A和1B，有关不同条件的方法详细信息参阅STAR方法）。我们分析了四种条件下的测定读数（图S2；表S3），并使用条件4（有关详细方案参阅STAR方法）进行大规模筛选。具体而言，每种肠道细菌先被接种并在其相应的液体培养基中培养。当其生长到早期稳定期，我们用PBS清洗细菌细胞，并重悬于包含20种氨基酸，维生素和多种补充剂的测定缓冲液中。在不同的时间点（15、30和60分钟），我们通过使用LC-MS量化测定缓冲液中剩余氨基酸的浓度来评估每种细菌的氨基酸消耗效率（图1C和1D）。 我们选择条件4是因为它以更受控的方式测定肠道微生物氨基酸代谢：在稳定期后期收集的经过PBS洗涤的活细胞重悬于具有确定的营养物质和氨基酸浓度的反应缓冲液中。这种情况还确定了几种肠道微生物，如C. sporogenes和B. ovatus，是特定氨基酸（如芳香氨基酸和谷氨酰胺）的有效代谢菌（图S2），其肠道和循环浓度在微生物定植宿主肠道后会降低（图2A）。利用这种条件，我们检测了具有以下四个特征的104种微生物：（1）它们在系统发育上具有多样性，包括跨越人类肠道微生物组中四个主要门的104个菌种；（2）可在实验室培养；（3）大部分已基因组测序并注释；（4）它们常见于健康的人类肠道中。 该大规模的代谢组学筛选（图1E）得到了一些有趣的观察结果：（1）肠道细菌氨基酸消耗效率与系统发育之间的相关性在不同水平上有所不同。同一目或科内的肠道细菌菌株（拟杆菌属微生物除外）表现出不同的氨基酸消耗活性。同一属或同一物种内的微生物，例如拟杆菌和梭状芽胞杆菌，更可能具有相似的氨基酸代谢模式。（2）有趣的是，一些梭状芽胞杆菌微生物（例如梭状芽孢杆菌C. sporogenes ATCC15579和塞内加尔梭状芽胞杆菌C. senegalense DSM25507）是多种氨基酸的快速代谢菌，包括精氨酸、芳香氨基酸、支链氨基酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸等。计算分析表明，这些微生物含有“Stickland fermentation”的候选代谢基因，涉及将氨基酸氧化和还原为小有机酸（表S4），这可能有助于它们有效利用特定氨基酸（如精氨酸和脯氨酸）。许多拟杆菌共生菌是肠道多糖（或聚糖）的主要利用者，也是多种氨基酸的熟练利用者，例如天冬酰胺、天冬氨酸和谷氨酰胺（图1E）。（3）不同的蛋白原性氨基酸种类具有独特的肠道细菌代谢者，其相应的消耗效率差异显着。还有几种厚壁菌门微生物，例如Clostridium thermarum GA15002（表S1中的47个）、Lachnospiraceae HM-7（表S1中的第48个）和Ruminococcus lactaris ATCC 29176（表S1中的第49个），在这种特定的测定条件下它们没有显示任何氨基酸的代谢。天冬酰胺和谷氨酸被许多拟杆菌和几种梭菌微生物很快利用（图1E）。相比之下，色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸和支链氨基酸仅被少部分特定的的厚壁菌门/梭状芽胞杆菌微生物（包括Blautia hydronotropicica DSM10507和C. sporogenes）以较低的效率消耗（图1E）。  图2 肠道氨基酸的微生物代谢影响宿主肠道和循环氨基酸稳态 A：单一定植B. ovatus (Bo)、C. senegalense (Ce) 和C. sporogenes (Cs) 野生菌的无菌C57BL/6J小鼠与GF对照相比，野生型菌株的肠道Asn、Gln、His、Lys、Pro和Trp浓度降低（n = 4-6）。粪便样品信号均为内标和粪便重量标准化后的结果。 B：B. ovatus、C. senegalense和C. sporogenes的定植也会降低Asn、Gln、His、Lys、Pro和Trp的血清浓度。样品按照内部标准标准化。 接下来，为了确定这些微生物是否在体内调节宿主的氨基酸分布，我们用鉴定出高效代谢氨基酸的单个细菌单定植GF小鼠，并分析了它们在粪便、胃肠道和血清中的氨基酸分布。体外代谢组学测定表明，Pro、Asn和His等氨基酸分别被肠道共生菌C. sporogenes、B. ovatus和C. senegalense迅速耗尽（图1E）。正如预期的那样，与GF小鼠对照相比，单菌定植小鼠胃肠道不同部分和粪便样本中相应氨基酸的浓度确实有所降低（图2A）。这种调节可以影响到外周器官或组织系统，因为血清样本中大多数相应氨基酸的浓度也显著降低（图2B）。综合起来，这些数据表明我们开发的基于代谢组学的测定可以估计微生物在宿主定植的情况下消耗肠道氨基酸的能力。然而，要注意肠道微生物可以通过多种机制改变宿主的氨基酸谱。该检测仅估计肠道微生物在体外代谢氨基酸的效率，这种效率可能部分反映（但不能完全预测）被检测微生物的定植如何影响宿主体内的氨基酸谱。 我们进一步分析了复杂的人类微生物组在离体环境中利用氨基酸的活性（图S3）。使用MiPro培养基培养从健康人类捐献者收集的30个粪便样本（据报道，该培养基可恢复复杂微生物组的至少80%的蛋白质功能），然后加入具有规定浓度的同位素标记的蛋白原氨基酸混合物（参见STAR方法了解方法详情）。我们观察到人类微生物群消耗氨基酸（例如Leu/Ile、His和Phe）的能力存在很大差异。此外，我们观察到部分氨基酸消耗效率水平与粪便氨基酸浓度呈负相关（图S3），表明微生物群氨基酸代谢是肠道微生物组控制人类宿主肠道氨基酸稳态的主要途径之一。 鉴定消耗氨基酸的微生物代谢基因 考虑到在单基因水平上对这种微生物编码的代谢活动进行功能研究将为了解它们对宿主生物学的影响提供机制见解，我们接下来试图鉴定负责有效利用氨基酸的微生物组基因。 我们瞄准满足三个标准的微生物群代谢基因：首先，这些微生物群代谢基因的编码酶使用氨基酸作为直接底物。这些细菌酶通常催化氨基酸转化的第一步，如转氨作用（“BCAA转氨酶”）、脱氨作用（“Arg脱亚胺酶”）、外消旋作用（Pro外消旋酶）或脱羧作用（Trp脱羧酶）（表1；图3）。其次，这些基因可以在高效代谢/利用氨基酸的肠道微生物中被识别（1E）。单一定植这些肠道细菌的GF小鼠的肠道和循环中相应氨基酸的浓度显著降低（图2）。最后，携带这些代谢基因的肠道微生物在遗传上是操作的，并已建立靶向性的基因敲除工具。 表1 本研究中突变的微生物代谢基因总结 该表显示了每种氨基酸的目标肠道微生物和代谢基因。删除的候选基因通过BioCyc（对于Arg、Cys、Glu、His和Met）进行预测，或者通过在其基因组（由Prokka注释）中搜索具有预期代谢功能的CDS来预测（例如BCAA，Trp，Pro，Ser和Thr的“转氨酶”)。本研究共产生35个突变株，其具体基因型见此表。影响微生物群氨基酸代谢的突变株用星号标记并对应于图3，其验证信息可在数据S1中找到。   图3 鉴定有效利用氨基酸的微生物代谢基因 多种非模式肠道微生物中氨基酸代谢基因的敲除和回补。对细菌野生型、基因缺失突变株和回补菌株应用相同的测定和计算（图1），以量化其氨基酸消耗效率。共产生了35个缺失突变株（表1）。影响相应氨基酸的微生物代谢的突变株包括Arg−（C. sporogenes的精氨酸脱亚胺酶adiA和adiB（ΔClospo_00894 + ΔClospo_03346）的双缺失突变株）；Asn−（B. ovatus的L-天冬酰胺酶的缺失突变株，ΔBACOVA_02827）；BCAA−（两个缺失突变株，C. senegalense和C. sporogenes中的BCAA转氨酶进行突变，分别为ΔCSGHG_RS19535和ΔClospo_03201）；Glu−（C. senegalense的谷氨酸变位酶缺失突变株，ΔCSGHG_RS11260）；His-（C. senegalense组氨酸氨裂解酶缺失突变株，ΔCSGHG_RS04365）；Lys−（C. senegalense赖氨酸5,6-氨基变位酶缺失突变株，ΔCSGHG_RS06670）；Met−（C. sporogenes蛋氨酸氨裂解酶缺失突变株，ΔClospo_00030）；Pro−（C. sporogenes脯氨酸还原酶缺失突变株， ΔClospo_02527）；Ser−（C. sporogenes丝氨酸脱水酶缺失突变株，ΔClospo_03760）；Thr−（C. sporogenes苏氨酸脱水酶缺失突变株，ΔClospo_00066）；Trp−（C. sporogenes的芳香族转氨酶和Trp脱羧酶 ΔClospo_01732 + ΔClospo_02083的双基因缺失突变株，可更有效地阻止C. sporogenes消耗Trp，B. hydronotropicica的芳香族转氨酶ΔRUMHYD_RS04985的单基因缺失突变株）。被敲除基因的详细信息见表1。“Comp”表示突变株的回补，通过将野生型代谢基因重新引入到敲除的菌株中，以恢复那些特定突变株中相应的代谢功能。有关基因敲除和回补的详细信息可以在STAR方法和数据S1中找到。 我们对几种肠道微生物进行了大规模基因敲除分析，包括B. hydronotropicica、B. ovatus、C. senegalense和C. sporogenes，这些微生物在体外筛选中表现出高效率地利用多种氨基酸（图1E）。其中一些能稳定地定殖在GF小鼠的胃肠道中，减少宿主胃肠道中相应的氨基酸（图2）。删除的候选基因可以通过BioCyc（Arg、Cys、Glu、His和Met）预测，也可以通过搜索其基因组（由Prokka注释）寻找具有预期代谢功能的CDs来预测（例如BCAA和Trp的转氨酶、Pro、Ser和Thr）（表1；图3）。 然而，三个挑战阻碍了对这些代谢基因及其对宿主营养稳态的影响的大规模分析。首先，大多数基因的分子功能注释模糊，且未经实验验证。例如，仅C. sporogenes基因组就包含至少17个编码序列被注释为“假定的氨基酸转氨酶”（表1和表S5），但哪个基因负责BCAA或Trp的有效转氨作用仍然未知（参与左旋多巴中代谢的一个基因除外）。其次，单一肠道微生物通常含有多个具有相同或相似蛋白质功能（用于氨基酸代谢）的基因。在C. sporogenes中，有2个基因编码注释为Arg脱亚胺酶的蛋白质，有4个基因编码注释为“半胱氨酸脱硫酶”的蛋白质。因此，这些蛋白质的催化功能可能是冗余的，并且需要具有多个基因缺失的突变细菌来消除其氨基酸代谢活性。最后，大多数肠道细菌是非模型微生物，其遗传学研究很少。例如，我们的LC-MS筛选结果显示，多种厚壁菌门/梭状芽胞杆菌微生物可能有助于微生物群的氨基酸代谢（图1B和1E）。然而，该细菌群的遗传工具集还不够发达。肠道共生梭菌的唯一遗传删除工具是Clostron和最近在C. sporogenes中开发的CRISPR-Cas9系统。这些系统是否可以迭代地应用于在这组细菌中敲除多个基因仍有待测试。 为了应对这些挑战，我们优化了之前开发的基因编辑系统，以促进C. sporogenes中的迭代基因删除（STAR方法和数据S1）。我们在这些肠道细菌中总共产生了35个缺失突变株（表1；表S5）。通过比较每个突变株与其野生型的氨基酸消耗效率，我们确定了多个用于代谢肠道氨基酸的候选基因（图3）。该基因目录还包括由B. ovatus编码的天冬酰胺酶基因，其同源物最近在B. thetaiotaomicron中被发现。这些突变株通过回补实验进行验证：我们在敲除的菌株中重新表达代谢基因，并检查该基因的回补是否恢复KO菌株代谢相应氨基酸的功能（图3）。我们对野生型和突变细菌中的下游途径特异性代谢物（如His对应的尿卡酸盐，图S4）进行了定量，以验证敲除的代谢基因确实参与了该途径。此外，我们对构建的大部分突变株的基因组进行了测序，以确保肠道微生物氨基酸代谢的下调是由于目标基因的破坏而不是脱靶效应（图3；数据S1）。我们的基因突变分析揭示了这些微生物代谢基因/酶的四个有趣特征： 首先，功能注释（Prokka）不足以精确预测它们的分子功能，特别是对于氨基酸转氨酶。像C. sporogenes这样的肠道微生物可能含有多达17个转氨酶拷贝（表1）。为了鉴定负责支链氨基酸和色氨酸转氨作用的基因，我们敲除了C. senegalense和C. sporogenes基因组中的16个转氨酶基因。出乎意料的是，敲除注释为BCAA转氨酶的基因（Clospo_1608和Clospo_02265）几乎不会影响产孢芽孢杆菌中BCAA的消耗。然而，我们发现了另一基因Clospo_03201（bctA）的的缺失显着降低了C. sporogenes消耗支链氨基酸的效率（图3；表1）。 其次，这些代谢酶对其底物具有高度选择性，但它们的催化功能可能是冗余的。例如，C. sporogenes中的转氨酶ArtA选择性地使Trp和Tyr脱氨，但其缺失几乎不影响C. sporogenes苯丙氨酸代谢（图3和S4A）。C. sporogenes含有两个Arg脱亚胺酶adiA（Clospo_00894）和adiB（Clospo_03346）拷贝。敲除任一对C. sporogenes精氨酸的利用影响很小，而adiA和adiB的双敲除突变株会阻断C. sporogenes精氨酸的消耗（图S4B）。 第三，具有各种催化功能的肠道细菌代谢基因可能对微生物群利用肠道氨基酸都有贡献。例如，在C. sporogenes中，虽然支链氨基酸和色氨酸等氨基酸通过转氨途径被代谢，但Pro通过还原路径被消耗。而Glu、Met、Ser和Thr则通过氨裂解酶被C. senegalense或C. sporogenes快速消耗。 最后，这些基因的催化功能是可转移的，在其他肠道共生菌中表达代谢氨基酸的基因赋予了消耗相应氨基酸的能力。我们通过在一株Clostridium bolteae中异源表达C. sporogenes精氨酸脱亚胺酶adiA显着提高了其精氨酸利用效率（图S4C）。 代谢氨基酸的基因广泛分布于人类肠道细菌 在确认这些基因利用氨基酸的分子功能后，我们研究了来自不同系统发育群体的肠道细菌中相关代谢酶及其同源物的分布情况。为了实现这一目标，我们使用了图3中验证的8个蛋白质序列，并对代表10个门的380种肠道细菌的基因组进行了BLAST分析（图S5）。我们的BLAST结果表明，大多数这些酶广泛分布在肠道细菌中，但有些酶表现出不同的分布模式。例如，L-天冬酰胺酶在拟杆菌门（Bacteroidetes）和假单胞菌门（Proteobacteria）中普遍存在，而芳香族氨基酸转氨酶和精氨酸脱亚胺酶主要存在于厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinomycetota）中。支链氨基酸转氨酶仅在拟杆菌门和厚壁菌门中观察到，而前消旋酶主要在厚壁菌门中普遍存在。此外，BLAST结果与我们之前的体外筛选结果在一定程度上是一致的。例如，大多数拟杆菌表现出快速消耗Asn的能力，而Pro降解菌仅在属于厚壁菌门的毛螺菌科和梭菌科中发现。这些结果表明，本研究中确定的微生物代谢基因广泛分布在人类肠道微生物中，并编码肠道细菌消耗蛋白原氨基酸的关键酶。 代谢肠道氨基酸的微生物基因调节宿主氨基酸稳态 在建立了一个微生物突变株库（消除了代谢个体氨基酸的能力）之后，我们接下来试图确定是否可以在宿主定植的背景下精确调节肠道氨基酸的微生物代谢。使用还原论方法，我们用野生型菌株或在体外测试下停止消耗氨基酸的细菌突变株对两组GF C57BL/6J小鼠（n = 4-7，同性）进行单一定殖（图3和4A）。我们通过小鼠粪便的菌落形成单位（CFU）监测小鼠的定植情况，并量化其生物样品中的氨基酸水平。这些代谢酶的敲除通常不会损害GF小鼠的细菌定植（图4B）。与对照菌株相比，C. senegalense Glu−突变株的CFU略有下降，可能是因为C. senegalense在宿主定植期间发酵谷氨酸作为碳/能源，而阻断其谷氨酸代谢可能对其胃肠道定植产生负面影响。我们从这些数据中得出了两个主要观察结论： 首先，多个已确定的微生物代谢基因/酶都能影响肠道氨基酸稳态。一般来说，由于基因敲除阻断了相应氨基酸的微生物代谢，突变组在肠道内容物和粪便中积累了较高的相应氨基酸（图4C和S1C）。对于某些氨基酸（如色氨酸），野生型和突变株差异没有那么显着，可能是因为C. sporogenes的色氨酸消耗效率较低（与其他氨基酸相比）（图1E）。这表明，这些消耗氨基酸的细菌酶的消耗效率可能决定微生物利用肠道氨基酸的能力，而不是它们的催化功能。其次，一些代谢基因影响宿主循环系统氨基酸谱。Asn、Leu/Ile、Pro和His利用缺陷的突变株定植的无菌小鼠在其血清中积累了显着更高的对应的氨基酸（图4D），这表明肠道菌也可能调节外周器官或组织中的氨基酸稳态。这种全身调节作用并不总是与共生菌代谢肠道氨基酸的能力相关。例如，C. sporogenes Arg-突变株的定植显着增加了肠道Arg水平。然而，它对循环系统中Arg的影响有限（图4D），可能是由于额外的调节层存在，例如肠上皮或肝脏代谢，这也可能有助于全身水平的Arg稳态。总的来说，这些数据表明：一些微生物代谢基因在宿主定植的背景下调节肠道和循环氨基酸稳态。同时也证明了利用微生物遗传学来调节宿主体内微生物群编码的代谢活动的可能性。  图4 单基因水平体内微生物氨基酸代谢的调节 A：GF C57BL/6J小鼠（n = 4–7）被单一野生型（WT）或敲除型（KO）细菌突变株定植模式图。 B：通过CFU确定WT和KO菌株的定植。 C、D：通过LC-MS对粪便（C）和血清氨基酸（D）水平进行定量。 被用于宿主定植的敲除突变株包括Arg−、Asn−、BCAA−、Glu−、His−、Pro−、和Trp−。 肠道微生物氨基酸代谢通过外周血清素调节宿主葡萄糖稳态 在证明微生物群的氨基酸代谢可以直接影响宿主的氨基酸稳态后，我们推测这种代谢活动也可能参与调节宿主中其他营养物质（如葡萄糖）的稳态，基于两个原因：（1）虽然之前的营养研究证明了支链氨基酸或色氨酸等特定膳食氨基酸的生物利用度与宿主葡萄糖耐量之间存在相关性，但其影响通常取决于具体条件且不太具有确定性。（2）基于之前发布的一组T2D患者的宏基因组数据集，我们计算了T2D患者和健康对照中bctA基因的相对丰度（图S6A，详见STAR方法）。该分析表明，与健康对照组相比，T2D患者中微生物BCAA转氨代谢基因的宏基因组丰度较高，表明微生物氨基酸代谢途径或许参与调节宿主葡萄糖稳态。我们优先考虑研究C. sporogenes的BCAA和Trp代谢通路，因为这两种氨基酸在宿主肠道和血液循环中含量丰富，并且在营养学研究中也表明与葡萄糖调控的变化相关。然而，人们对微生物代谢支链氨基酸或色氨酸如何影响宿主葡萄糖调控知之甚少。 为了评估这两种途径对宿主葡萄糖稳态的影响，我们在GF C57BL/6J小鼠（n = 4-5，性别匹配）分别定植了野生型C. sporogenes、BCAA−突变株或Trp−突变株并持续2周，然后进行口服葡萄糖耐量（OGTT）测定（图5A）。尽管在C. sporogenes不同菌株定植相似（图4B），但BCAA−突变株单定植的无菌小鼠的葡萄糖耐量相对于野生菌定植鼠有所改善（图5B），而Trp−突变株定植小鼠相对于C. sporogenes野生型定植对照则表现出相反的趋势（图5C）。  图5 肠道BCAA和Trp的微生物代谢通过外周血清素释放调节宿主葡萄糖稳态 A：通过口服葡萄糖耐量试验OGTT评估微生物代谢支链氨基酸和色氨酸对宿主葡萄糖稳态影响的实验方案。年龄性别匹配的C57BL/6J无菌小鼠（n = 4-5）在OGTT测定前已单一定植C. sporogenes WT、BCAA−或Trp−突变株2周。 B：用BCAA−突变株定植的小鼠比C. sporogenes WT定植的小鼠具有更高的葡萄糖耐受性。 C：被Trp−突变株定植的小鼠比C. sporogenes WT定植的小鼠的葡萄糖耐量更低。 D：与WT定植小鼠相比，BCAA−突变株定植小鼠血清中的血清素降低。与WT定植小鼠相比，Trp-突变株定植小鼠血清中的血清素升高。 E-G：实验方案（E）：检验肠道微生物消耗BCAA和色氨酸是否对葡萄糖稳态的调节作用是通过外周血清素释放实现的。WT组和突变组在OGTT测试前给予Thp1抑制剂LP53340144处理1周。如（B）和（C）中观察到的，组间差异化的葡萄糖调控分别在（F）和（G）中显著性低很多。 I：一个工作模型，显示肠道BCAA和Trp的微生物消耗如何通过外周血清素释放来调节宿主葡萄糖稳态。 我们试图探索这两种代谢途径调节宿主葡萄糖稳态背后的分子机制。对血清样本的代谢组学分析显示，与对照组相比，BCAA−组血清中的血清素水平降低，而Trp−组的血清素水平有升高的趋势，并且肠道组织中血清素相关基因的表达也存在差异（图5D和S6B)。先前的研究表明，肠道微生物组可以通过外周血清素调节宿主葡萄糖稳态，而循环血清素的减少会导致葡萄糖耐量改善。BCAA−或Trp−突变株中的血清素变化与其相应的葡萄糖稳态变化与文献结论一致（与野生型对照）。因此，由微生物氨基酸代谢的变化而导致的宿主葡萄糖调节的改变可能是由外周血清素释放介导的。为了验证这一假设，我们应用了相同的无菌小鼠设置，但在OGTT之前，对野生型和突变株的定植小鼠施用Tph1抑制剂LP533401（每日口服灌胃30毫克/千克）（图5E）。如预期的那样，野生型和突变型定植小鼠之间的葡萄糖耐受差异要小得多（图5E-5H）。这些数据综合表明，微生物氨基酸代谢活性的变化通过调节外周血清素合成影响宿主葡萄糖稳态。 - 讨论 - 虽然长期以来人们一直认为肠道微生物组成的变化与宿主营养稳态有关，但详细的分子机制在很大程度上仍然未知。我们的研究结合了生物信息学、微生物遗传学、代谢组学和无菌小鼠模型，以单基因分辨率表征了肠道微生物对肠道氨基酸的代谢如何影响宿主氨基酸稳态。我们鉴定了多种活跃代谢氨基酸的肠道细菌，并进行了大规模基因敲除分析，以找到对应的氨基酸代谢基因。通过无菌小鼠模型并结合功能测定，我们证明这些微生物编码的代谢途径通过直接直接调控宿主肠道和血液循环中氨基酸的生物利用度来影响宿主营养稳态或间接地通过外周血清素合成调节宿主葡萄糖耐受。这些微生物氨基酸代谢基因及同源基因在多个门的肠道共生菌中广泛存在，这某种程度表明了一种广泛的微生物参与的调节宿主营养稳态的机制。我们的研究结果表明，定植的微生物可以以“竞争”模式与宿主相互作用，进而深入了解微生物如何在分子机制水平上调节宿主营养稳态以及相关的生理学。 具有各种催化功能的微生物酶可以促进微生物组消耗肠道氨基酸并调节宿主氨基酸图谱。通过我们的大规模基因编辑分析鉴定出的这些微生物酶包括氨基酸转氨酶、脱羧酶、消旋酶和氨裂解酶。这些代谢酶有两个共同特征：它们由肠道共生菌成员编码，可有效消耗环境/肠道蛋白原氨基酸，而氨基酸是大多数这些细菌酶的直接底物。值得注意的是，相关的微生物代谢途径有时在单个肠道细菌中是冗余的，例如C. sporogenes代谢精氨酸的情况。因此，正如我们和之前的研究表明，宿主营养稳态很可能是由微生物组和人体代谢系统共同维持和调节的，并且在分子水平上表征微生物组将为精确操纵肠道微生物以改善人类肠道和代谢健康提供更多的见解。 我们的研究也存在一些限制。首先，虽然我们观察到肠道微生物消耗氨基酸是其改变肠道氨基酸图谱的一种途径，但微生物氨基酸合成或运输等其他途径也可能对宿主氨基酸稳态有贡献。我们的体外测定仅评估肠道微生物在特定条件下代谢氨基酸的效率，这种效率部分反映了它们的定植可能如何改变宿主的氨基酸谱。其次，在这个工作中，我们使用了还原论方法，将野生型肠道微生物及其单个氨基酸利用途径缺陷的同基因型突变体定植于GF小鼠中。未来需要在更生理相关的模型中进一步研究研究这些途径，例如用简化的肠道微生物组或寡小鼠微生物组等简化微生物组定植的GF小鼠。第三，尽管我们已经证明在宿主定植背景下我们可以精确操纵单个途径微生物的氨基酸代谢，未来需要更多的努力和技术进步来开发有效的方法，以在更复杂的微生物组背景下精确操纵这些基因。最后，为了探索这些代谢途径的生物学影响，我们比较了野生型和突变型共生菌定植的无菌小鼠之间的生理差异。未来需要进一步的研究来阐明生理表型相关的宿主细胞和信号通路。 - 通讯作者简介 - |
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