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大家好，今天跟大家分享一篇题为N6-meth yla denosine modifi cation is not a general trait of viral RNA genomes（N6-甲基腺苷修饰不是病毒RNA基因组的一般特征）研究团队首先检测CHIKV RNA是否含有m6A修饰。研究人员在HEK293T和Huh7细胞被感染12小时后对细胞样本进行RNA提取并进行LC-MS/MS分析，结果显示CHIKV RNA中未发现m6A修饰富集。 01 研究背景 尽管 m 的核定位6据报道，基孔肯雅热 （CHIKV） 和登革热 （DENV） 等多种排他性细胞质 RNA 病毒的基因组被广泛传播。6A修改。然而，这些发现大多基于 m6A-Seq，一种具有高假阳性率的抗体依赖性技术。在这里，我们解决 m 的存在6CHIKV 和 DENV RNA 中的 A。 为此，我们将 m6A-Seq和抗体非依赖性SELECT和纳米孔直接RNA测序技术，具有功能、分子和诱变研究。经过这一综合分析，我们没有发现任何证据6CHIKV 或 DENV 转录本的修改。 此外，主机关键组件的耗尽6机器不影响 CHIKV 或 DENV 感染。此外，CHIKV 或 DENV 感染对 m 没有影响6机械的本地化。我们的研究结果挑战了流行的观念，即 m6修饰是细胞质RNA病毒的一般特征，并强调了用正交方法验证RNA修饰的重要性。 见图一 质谱法和m6CHIKV RNA 的 A-IP-qRT-PCR 分析显示没有 m6修改。  图一 a CHIKV感染期间产生的基因组RNA（gRNA）和亚基因组RNA（sgRNA）的示意图。 b M 的 LC-MS/MS 定量6从模拟或 CHIKV 感染的 HEK293T 和 Huh7 细胞中分离的 poly（A） + RNA 修饰。细胞感染 12 小时，感染多重性 （MOI） 为 4。对 HEK293T 个样品分析了 ~100 ng 消化的核糖核苷，对每个 Huh7 样品分析了 ~75 ng。条形图显示三个生物重复的平均值，误差线显示标准差 （SD）。N.S. 不重要。**p < 0.01，使用未配对的双尾 t 检验，p 值 = 0.0005。本文提供了源数据。 c 沿 CHIKV RNA 平铺的 qPCR 扩增子的描述6A-IP-qRT-PCR分析。 d 对 m 的宿主SLC39A14转录本中阴性 （−） 和阳性 （+） 对照 qPCR 扩增子的描述6A-IP-qRT-PCR分析。 E M6使用从不同 CHIKV 感染细胞系中分离的总 RNA 进行 A-IP-qRT-PCR。RNA片段化至~1 kb。11 套引物（每 KB 一套：CHIKV_1 至 CHIKV_11）41沿着 CHIKV RNA 平铺。条形表示 3 m 的平均± SD 值6来自 HEK293T 和 Huh7 细胞系的 3 个独立感染以及来自 2 个独立 m 的 A-IP6U2OS 细胞系的 A-IP。所有细胞系均以4的MOI感染12小时。本文提供了源数据。 f 通过qRT-PCR定量总RNA样品中的细胞内SLC39A14和病毒RNA水平，并针对管家基因GAPDH进行归一化。对于每个细胞系，SLC39A14 RNA 水平设置为 1，病毒 RNA 水平相对于 SLC39A14 表达。条形图显示 3 种独立感染的平均值，误差线显示 SD。所有细胞系均以4的MOI感染12小时。本文提供了源数据。 见图二 米6CHIKV RNA 的 A-Seq 分析揭示了单个推定的 m6一个高峰。  图二 a 在保守的 m 中鉴定出最显著的富集基序6A 在 CHIKV 感染的细胞中跨细胞 poly（A） + RNA 达到峰值。采用HOMER软件进行基序分析。 b 基因组浏览器跟踪显示映射的 CHIKV 读数（菌株 LR2006-OPY1）用于输入和 m6A-IP 示例。使用每百万归一化计数将读段缩放到与病毒基因组相同的读段深度。每种条件的两种生物学重复（input 和 m6A-IP） 显示在每个轨道中。共同的m6指示了m6aViewer和MACS2识别的峰。m的倍数变化6A-IP/输入，从两个重复的平均值显示在调用的 m 上方6一个高峰。HEK293T细胞感染12小时，MOI为4。指示由 11 个引物组（CHIKV_1 至 CHIKV_11）产生的 11 个 qPCR 扩增子。跨越 CHIKV m 的 qPCR 扩增子6还显示了一个峰值。 c 基因组浏览器跟踪显示输入和 m 的映射读数6SLC39A14转录本中的 A-IP 样本。使用每百万计数 （CPM） 归一化对合并的基因组进行读取。SLC39A14 qPCR 扩增子用作阴性和阳性对照，单位为 m6还需使用 A-IP-QRT-PCR。 d CHIKV 感染的 HEK293T 细胞中所有 23,539 个 m6aViewer 称为细胞峰的 log2 倍数变化 （log2FC） 分布的小提琴和箱形图，在两个独立重复之间保守。SLC39A14峰和CHIKV峰用红点表示。箱线图显示中位数（中线）、第 25-75 个百分位数值和 1.5 倍四分位距，而叠加的小提琴图显示完整的数据分布。 E M6执行 A-IP-qRT-PCR 以验证推定的 m6通过 m 鉴定的峰6A-序列。HEK293T细胞感染12小时，MOI为4。总RNA片段化至100–200 nt。条形图显示 3 m 的平均值6来自 3 个独立感染的 A-IP，误差线显示 SD。CHIKV_10和CHIKV_11引物组用作阴性对照，扩增区域没有m6根据我们的 m6A-Seq数据。N.S. 不显著（p > 0.05，使用双尾 t 检验）。 见图三 CHIKV RNA的SELECT分析显示没有m6修改。  图三 a SELECT技术示意图34.我们设计的DNA寡核苷酸可以退火到假定的修饰的DRACH（在修饰的位点留下间隙）或退火到相邻的非修饰腺苷作为对照。在m6修改。DRACH 图案用黄线突出显示。 b 使用总 RNA 或 CHIKV 体外转录 （IVT） RNA 进行的 SELECT 技术。HEK293T细胞感染12小时，MOI为4。扩增的阈值周期差（ΔCT） 的总 RNA 与 IVT ΔC 的比较T显示每个主题 （1–8）。如果总 RNA ΔCT= IVT ΔCT，值将在实线对角线上对齐。如果存在 −1 C 的差异T总RNA ΔC之间的循环T和 IVT ΔCT，表示主题是 m6经过 A 修改后，值将在对角线不连续线上对齐。这个 C 越低T总RNA ΔC之间的循环差T和 IVT ΔCT，m6DRACH 图案中存在修改。所有实验均在三个技术重复（单独的SELECT反应）中进行。所有 CTSELECT结果的值可以在补充图中找到。1b 和源数据。结果代表了两种独立的感染。 见图四 CHIKV RNA 的 DRS 分析未显示抗体依赖性 m 内的修饰6一个高峰。  图四 a 与 CHIKV IVT 样本对照（使用默认参数）相比，在 HEK293T 个感染样本（12 小时，p.i，MOI 为 4）中沿 CHIKV 基因组获得的 NanoConsensus 评分。在灰色、不重要的位置;蓝色表示 NanoConsensus 仅在一次重复中鉴定的区域;红色表示在两个重复中识别的区域。 b 沿 CHIKV 的基因组（上图）和亚基因组转录本（下图）的 NanoConsensus 评分（使用默认参数）。在灰色、不重要的位置;蓝色表示 NanoConsensus 仅在一次重复中鉴定的区域;红色表示在两个重复中识别的区域。我们应该注意到，在转录本末尾的一个重复中发现的潜在修饰通常是假阳性，这是由读取末端的纳米孔信号的高噪声引起的。 见图五 METTL3、FTO或YTHDF1耗竭对CHIKV感染的影响。  图五 将稳定的shRNA HEK293T细胞系以4的MOI感染12小时。siRNA 处理（siControl 和 siYTHDF1）HEK293T细胞在敲低 48 小时后感染 12 小时，MOI 为 4。Scr. scramble， h p.i. 感染后数小时。 a 蛋白质印迹定量分析代表了 2 种独立感染。β-肌动蛋白显示为上样对照。来自每个条带下方的耗尽样品的β肌动蛋白归一化值相对于其对照显示。未裁剪的印迹可以在源数据中找到。 b 通过qRT-PCR定量细胞内病毒RNA水平，并针对管家基因GAPDH进行归一化。贫化样品中的gRNA水平相对于其相应的对照显示。条形图显示了 3 种独立感染的平均值，误差线显示 SD。 c 在 12 小时 p.i. 从 CHIKV 感染的对照和敲低细胞中收集的上清液通过HEK293T细胞中的斑块测定滴度。条形图显示 3 个独立重复的相对平均值，误差线显示 SD。所有统计分析均使用双尾t检验进行。n.s. 不显著，**p < 0.01，p 值 = 0.0016。 见图六 米6DENV RNA 的 A-Seq 分析揭示了单个推定的 m6一个高峰。  图六 a 登革热病毒感染期间产生的正义和反义基因组RNA的示意图。 b 平铺 DENV qPCR 扩增子的示意图6A-IP-qRT-PCR分析。 c 米6使用片段化至 ~1 kb 的总 RNA 对不同的 DENV 感染细胞系进行 A-IP-qRT-PCR。沿 DENV RNA 平铺 11 组引物（每 kb 一组：DENV_1 至 DENV_11 组）。条形图显示 3 m 的平均值63 个独立感染的 A-IP，误差线显示 SD。所有细胞系均以 2 的 MOI 感染 48 小时。本文提供了源数据。 d 通过qRT-PCR定量细胞内病毒RNA水平，并针对管家基因GAPDH进行归一化。对于每个细胞系，病毒RNA水平相对于SLC39A14表达。条形图显示 3 种独立感染的平均值，误差线显示 SD。所有细胞系均以 2 的 MOI 感染 48 小时。本文提供了源数据。 e 在保守的 m 中鉴定出最显著的富集基序6A 在 DENV m 中跨细胞 RNA 的峰值6A-Seq数据。采用HOMER软件进行基序分析。 f 基因组浏览器轨迹显示映射的 DENV-2（菌株 16681）的输入和 m6A-IP 示例。使用每百万归一化计数将读段缩放到与病毒基因组相同的读段深度。每个轨道中显示每种条件的所有生物学重复。保守的 m6aViewer 称为 m6MACS2也发现了一个峰。 m的倍数变化6A-IP/输入，所有重复的平均值显示在调用的 m 上方6一个峰值。Huh7 细胞感染 48 小时，MOI 为 3。其他已发布的 DENV-2 m6显示同一细胞系中的A-Seq样品作为比较。 Gokhale等人。39在MOI为2（24小时p.i.）时使用DENV2-NGC菌株，而Gokhale等人。53在MOI为1（48小时p.i.）时使用DENV2-NGC菌株。指示由 11 个引物组（DENV_1 至 DENV_11）产生的 11 个 qPCR 扩增子。跨越保守的 DENV m 的 qPCR 扩增子 m6还显示了一个峰值。 g DENV 感染的 Huh7 细胞中所有 37,173 个 m6aViewer 称为细胞峰的 log2 倍数变化 （log2FC） 分布的小提琴和箱形图，在两个独立重复之间保守。SLC39A14 和 DENV 峰用红点表示。箱线图显示中位数（中线）、第 25-75 个百分位数值和 1.5 倍四分位距，而叠加的小提琴图显示完整的数据分布。嗯6执行 A-IP-qRT-PCR 以验证推定的 m6通过 m 鉴定的峰6A-序列。 Huh7 细胞感染 48 小时，MOI 为 2。总RNA片段化至100–200 nt。条形图显示 3 m 的平均值6来自 3 个独立感染的 A-IP，误差条显示 SD。DENV_5 和 DENV_10 引物用作阴性对照病毒引物扩增区域，未观察到任何 m6根据我们的 m 进行丰富6A-Seq数据。 见图七 DENV RNA的SELECT和诱变分析显示没有m6修改。  图七 a 使用从感染 DENV-2（野生型）的 Huh7 细胞中以 2 的 MOI 提取 48 小时或从感染 HEK293T 细胞以 0.5 的 MOI 提取的总 RNA 进行 SELECT。此外，使用SLC39A14 RNA 中含有修饰的 DRACH 基序的 ssDNA 以及 DENV-2 体外转录 （IVT） RNA 进行 SELECT 反应。扩增的阈值周期差（ΔCT） 的总 RNA 与 IVT ΔC 的比较T显示每个图案 （1–13）。如果总 RNA ΔCT= IVT ΔCT，值将在实线对角线上对齐。如果存在 −1 C 的差异T总RNA ΔC之间的循环T和 IVT ΔCT，表示主题是 m6经过 A 修改后，值将在对角线不连续线上对齐。所有实验均使用三个技术重复（单独的SELECT反应）进行。所有 CTSELECT结果的值可以在补充图中找到。7 和 8 以及源数据。 b 先前阐明的 DENV-2 RNA 中保守的 RNA 元件55以蓝色显示。m6一个峰（9114–9414 nt）在所有m6A-Seq研究以紫色显示。 c 通过SHAPE信息结构分析鉴定的DENV-2野生型（WT）中保守RNA环（黄色圆圈）的示意图55，其中包含 DRACH 基序 8（AAACA，带下划线的核苷酸）。蓝色矩形突出显示了 DENV-1、DENV-2 和 DENV-4 血清型中的类似结构55.推定的修饰腺苷位于 9293 位。该原理图改编自 Boerneke 等人。 d DENV-2突变体（Mut）病毒的示意图，携带一个突变，其中DRACH基序8内的胞嘧啶（位于9294位）变为尿苷（以红色显示）。使用从 Huh7 细胞或 HEK293T 细胞（均感染 DENV-2 Mut 以 0.5 的 MOI 感染 96 小时）提取的总 RNA 进行 。 e SELECT 以测试 DENV-2 突变基序 8。此外，以DENV-2突变体外转录（IVT）RNA为对照进行SELECT反应。所有实验均使用三个技术重复（单独的SELECT反应）进行。条形图显示三个 SELECT 反应的平均值，误差线显示 SD。ΔCT显示了使用从 DENV-2 野生型 （WT） 感染细胞中提取的总 RNA 和相应的 DENV-2 WT IVT 的 SELECT 反应值以进行比较。 02 研究结论 综上所述，这些结果表明 CHIKV 和 DENV 不包含 m6一种可以通过抗体非依赖性技术进行验证的修饰。相比之下，m6本研究中采用的所有方法都很容易检测到在细胞核中复制的 DNA 病毒的宿主 RNA 和病毒转录物中发现的修饰，这突出了对 RNA 修饰进行正交抗体非依赖性验证的重要性。 好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。 |
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