单抗融合操作步骤

单抗融合是一项关键的生物技术实验，用于制备单克隆抗体。以下是一份详细的单抗融合操作步骤指南，基于最新的实验技术和实践。

一、实验准备

1. 实验器材与试剂

在开始实验前，请确保以下器材和试剂已准备齐全：

·         细胞融合所需器材：离心管、离心管架、剪子、镊子、匀浆器、细胞筛网、培养皿、固定板等。

• 细胞融合所需试剂：1640不完全培养基MAC0016、PEG融合剂（如PEG1450）MAC0011、HAT完全培养基MAC0013、胎牛血清MAC0010、双抗（链霉素和青霉素）、HAT或HT选择性培养基等。

2. 试剂配制

·         实验前取PEG融合剂（如PEG1450）1ml于无菌EP管中，置于37℃预温。

·         HAT完全培养基：按照20%胎牛血清+1%双抗+1/50体积的HAT（50×）+1640不完全培养基的比例配制，每块96孔板约需20ml，同样置于37℃预温。

·         分取50ml 1640不完全培养基，同样置于37℃预温，用于融合后稀释PEG。

二、实验前准备工作

·         将实验所需器材放入超净台，紫外照射30分钟左右，以确保无菌环境。

三、饲养细胞与融合细胞准备

1. 饲养细胞的制备

饲养细胞可以辅助融合杂交瘤细胞的生长，但也可能增加污染风险，需谨慎操作。

·         取空白Balb/c小鼠，眼球取血处死，浸入75%乙醇中消毒5分钟。

·         将小鼠固定在无菌固定板上，剖开腹部皮肤，用注射器向腹腔内注入1640不完全培养基，轻轻按摩后回收。

·         取出小鼠脾脏，剪去表面脂肪，放入匀浆器中研磨，并通过细胞筛网过滤。

·         将过滤后的细胞悬液离心，弃上清，重悬于HAT完全培养基中，即可用于铺板或混合铺板。

2. SP2/0细胞制备

SP2/0细胞MAC0022作为骨髓瘤细胞，是单抗融合的重要组成部分。

·         对于培养细胞，直接吹打悬浮后离心计数使用。

·         对于实体瘤SP2/0，需按饲养细胞制备步骤处理小鼠，取出实体瘤后研磨、过滤、离心，重悬于1640不完全培养基中备用。

四、单抗融合操作步骤

1. 细胞混合与离心

·         用1640不完全培养基将SP2/0细胞和免疫鼠脾细胞重悬，分别计数后按一定比例（如脾细胞/0细胞=1:3）混合于50ml无菌离心管中。

·         加入适量1640不完全培养基至总体积约40ml，离心（如1500rpm，5分钟）使细胞沉淀。

2. 融合剂PEG的加入与稀释

·         离心后弃去上清液及管壁液体，轻轻敲打离心管底部使细胞沉淀松动。

·         将离心管底部浸入37℃温水中保持温度。

·         从培养箱中取出已预温的PEG融合剂，在60秒内均匀滴入细胞混合沉淀中，边滴加边转动离心管。

·         静置温育45秒后，开始稀释融合剂。取出预热的1640不完全培养基，先取1ml在60秒内均匀滴入沉淀中，再取1ml在30秒内滴入，最后将剩余的45ml培养基慢慢滴入并混匀。

3. 细胞重悬与铺板培养

·         稀释融合剂后，轻轻颠倒混匀离心管内的细胞悬液，再次离心（如1500rpm，5分钟）并弃去上清液。

• 用含有饲养细胞的HAT完全培养基重悬细胞沉淀（如总体积200ml）。若饲养细胞已提前铺板，则只需用100ml的HAT完全培养基重

·         将重悬后的细胞均匀铺入96孔细胞培养板中（如200μl/孔），置于5% CO2、37℃的培养箱中培养。

·         培养7天后，用HAT完全培养基换液一半。根据实验需要，也可选择半固体培养基培养方式。

五、杂交瘤细胞筛选与亚克隆

1. 阳性细胞孔的筛选

·         一般采用间接ELISA法筛选阳性细胞孔。需先确定抗原最佳包被浓度并建立好ELISA检测方法。

·         按最佳包被浓度包被ELISA板后，加入杂交瘤细胞培养上清进行检测。根据OD值选取阳性值最高的孔予以保留并进行亚克隆。

2. 阳性杂交瘤细胞的亚克隆

·         亚克隆的目的是为了得到单个细胞（单克隆）分裂生长的细胞群。一般采用有限稀释法或半固体培养基法进行亚克隆。

·         在亚克隆过程中需使用HT完全培养基等选择性培养基以促进杂交瘤细胞的生长和分化。

六、注意事项

·         在整个实验过程中需严格遵守无菌操作规范以防止污染。

·         融合剂PEG的分子量和浓度需根据实验需求进行选择和优化。

• 饲养细胞的使用需谨慎操作以避免对融合造成负面影响。

• 特别推荐使用用杂交瘤添加因子10×MAC0014

·         在杂交瘤细胞筛选和亚克隆过程中需耐心观察和细致操作以确保实验成功。

以上单抗融合操作步骤仅供参考，具体实验条件可能因实验室设备、试剂品牌等因素而有所不同。在实际操作中请根据实际情况进行调整和优化。另外推出单抗融合套装MAC0001，新手操作首选.