 研究论文 ● 期刊：Nature Microbiology(IF:20.5) ● DOI：https:///10.1038/s41564-025-01973-1 ● 原文链接: https://www./articles/s41564-025-01973-1 ● 第一作者：Daniel Garrido-Sanz ● 通讯作者：Daniel Garrido-Sanz(daniel.garridosanz@unil.ch)&Christoph Keel(christoph.keel@unil.ch) ● 发表日期：2025-3-26 ● 主要单位： 瑞士洛桑大学基础微生物学系 微生物群落在维持植物健康和提高生产力方面发挥着至关重要的作用。可重复的、源自自然的植物共生微生物组有助于解析不同时间和空间尺度上的微生物动态。在此，我们采用连续传代策略，构建了一个复杂且可重复的小麦根际微生物组（rhizosphere microbiome, RhizCom），以研究微型生境中土壤微生物与可遗传的种子携带型根际微生物组（seed-borne rhizosphere microbiomes, SbRB）之间的演替动态及相互作用。利用16S rRNA基因测序和宏基因组测序，研究发现，相较于本土土壤微生物，SbRB成为根际微生物组的主要来源。SbRB基因组富集了宿主相关性状，包括关键糖类的降解（生态位分化）以及通过互养作用支持共生菌株的生长（生态位促进）。体外共培养实验进一步证实，某些SbRB菌株可促进共生细菌在二糖作为唯一碳源的条件下生长。研究揭示了种子微生物群在微生物演替和群落组装中的重要作用，这为作物微生物组的调控策略提供了理论依据。 顺序演替驱动门特异性选择 为了获得一个可操作的小麦根际微生物组，我们使用土壤微生物组细胞悬浮液作为初始接种物，在小麦（Triticum aestivum cv. Arina）根际进行了六次连续的微生物组传播。在植物生长7天后，收集根际并获得根际细胞悬浮液，用于重新接种下一个循环（图1a和扩展数据图1）。种子携带根际微生物组（SbRB）是从16株未接种植物的1个循环中获得的。我们通过分析小亚基（16S）rRNA基因来追踪细菌群落动态。观察到从初始土壤微生物组组成发生了强烈转变，主要是由属于变形菌门和拟杆菌门的细菌选择引起的，其次是一些厚壁菌门和疣微菌门的成员（图1b和附图1）。与演替循环中观察到的微生物组组成相比，SbRB和土壤样本最为不同，显示出趋同的轨迹（图1c、d）。在初始循环中被选择的类群在整个剩余步骤中得以维持（图1e和附图2），这与系统发育多样性（Spearman相关性，R = -0.15，P = 0.49）和菌落形成单位（c.f.u.）计数的稳定一致（图1f、g和附表1）。然而，观察到香农多样性（Spearman相关性，R = -0.85，P = 1.2×10-7，图1h）和其他α多样性指数的逐渐下降（附图3）。这些数据表明，在所使用的微宇宙条件下，建立了一个稳定且多样的小麦根际群落（RhizCom），由属于126个不同属的464个扩增子序列变体（ASVs）组成（附表2）。通过在小麦根际重新种植保存在-80°C的RhizCom来验证RhizCom的可重复性，其分类组成、ASVs数量和香农多样性与最后一个传播周期的群落相似（图1，附图3和附表3）。  图1 | 小麦根际微生物组的顺序演替 a. 研究土壤和种子携带根际细菌融合的微宇宙实验设计（详细信息见扩展数据图1）。 b. 在纲水平上，相对丰度最高的500个ASVs的CSS标准化相对丰度。 c. 样本重复（每个样本n=4）的Bray-Curtis差异聚类显示了种子携带根际细菌（SbRB）、土壤、土壤冲洗液和演替循环之间的明显区别。 d. 基于样本间Bray-Curtis差异的主坐标分析（PCoA）。椭圆代表99%置信区间（CI）。 e. 小麦根际微生物组演替过程中ASVs的选择。使用总平均（n=4）相对丰度≥0.005%的ASVs构建了系统发育树。从内到外，彩色点代表ASVs，其大小对应于它们在样本中的平均相对丰度。详细信息见附图2。 f. 每克土壤（土壤冲洗液n=28）或根际（循环1 n=20；循环2 n=21；循环3 n=22；循环4 n=23；循环5 n=15；循环6 n=20；回收n=8；SbRB n=16）上R-2A琼脂平板上的细菌菌落形成单位（c.f.u.）计数。中心线表示中位数，方框跨度为第一到第三四分位数，须线延伸至1.5×四分位距。超出此范围的异常值以黑点表示。 g,h. 表示样本间费思的系统发育多样性（g）和香农多样性（h）的测量值。条形图（±标准差）表示平均值。黑点代表单个重复（n=4）。不同字母表示通过Kruskal-Wallis检验，随后进行费舍尔事后检验和FDR P值校正后确定的显著不同组（P≤0.01）。插入图显示了α多样性测量值与演替循环之间的斯皮尔曼相关性（红线，平均值；点，重复（n=4））。 可遗传的种子携带根际细菌（SbRB）是主要的根际微生物组来源 我们通过识别与种子携带根际细菌（SbRB）或土壤群落完全匹配的扩增子序列变体（ASVs），来考察RhizCom成员的来源，因为这两个群落是仅有的可能来源。只有少量的RhizCom ASVs能够追溯到任一来源群落（11.4%，图2a和附表3）。具体来说，我们在RhizCom微生物组中检测到33个来自土壤接种物的ASVs和25个来自SbRB的ASVs，它们共同占RhizCom总相对丰度的51%。值得注意的是，一个在土壤接种物和SbRB群落中都检测到的Flavobacterium ASV和一个Serratia ASV，占RhizCom的43.3%（附表3）。土壤冲洗液和SbRB ASVs对RhizCom的贡献分别代表了它们各自微生物组相对丰度的4%和84.7%。大多数未追溯到来源群落的RhizCom ASVs在演替循环中出现（占RhizCom ASVs的70.9%），这表明个体可遗传的SbRB异质性在RhizCom中得以保留（附表3）。这一发现进一步得到了在循环过程中ASV出现减少的证据支持，主要影响低丰度类群（图2b）。未在任何条件下检测到的RhizCom ASVs（82个，图2a）在RhizCom中的代表性较低（其中85%的相对丰度低于0.01%，附表3），可归因于其循环中特定的SbRB异质性。这些结果表明，在早期生态位发育过程中，SbRB在根际组装中占主导地位，这可以归因于它们作为先锋物种的效应，因为它们是第一批到达发育中的根际环境的微生物。  图2 | 种子携带根际细菌（SbRB）对根际微生物组（RhizCom）的贡献 a. 可追溯到初始土壤冲洗接种物或种子携带根际细菌（SbRB）的根际微生物组（RhizCom）ASVs。左侧：全流图显示了3个样本中ASVs的连接。仅考虑RhizCom（第6次演替循环）中存在的ASVs。重复样本（n=4）通过平均值合并。百分比显示了对RhizCom有贡献的ASVs的合并CSS标准化相对丰度，随后是样本中ASVs/总ASVs的数量，颜色/灰色根据样本而定。颜色根据ASVs的纲水平分类而定。右侧：甜甜圈图显示在土壤冲洗液或SbRB中检测到的RhizCom ASVs的数量。 b. 在演替循环中ASVs的出现。线条表示在每个循环中在不同相对丰度阈值下检测到的新ASVs的数量。 c-f. 使用DESeq2计算差异ASV丰度，采用双侧Wald检验进行显著性检验，并进行局部离散度估计。具有|log2（倍数变化）|≥2.5且Padj.<0.01的ASVs被认为具有显著性。结果以关键比较的火山图表示。点代表ASVs，根据门进行着色，并根据其相对丰度进行大小调整。每个条件下的差异丰度ASVs的数量在维恩图中显示（NS，不显著）。在d和f的右侧：对与土壤冲洗液或SbRB样本相比在RhizCom中最耗尽的ASVs进行标记的放大图。详细信息见附图4。 初始土壤接种物与根际微生物组（RhizCom）之间的比较揭示了最显著的变化，其中土壤冲洗液中有808个ASVs富集，而RhizCom中只有133个ASVs富集（图2c-f）。这表明群落组成存在显著差异，暗示了强烈的宿主介导的选择压力。与RhizCom相比，种子携带根际细菌（SbRB）中富集的ASVs数量较少（分别为14个和313个ASVs）。这表明群落组成存在显著差异，暗示了强烈的宿主介导的选择压力。RhizCom中ASVs的富集主要影响变形菌门和拟杆菌门，而厚壁菌门，特别是芽孢杆菌属（Bacillus），在土壤接种物中更为富集（附图4）。某些种子携带根际细菌（SbRB）的ASVs（如假单胞菌属Pseudomonas、马西利亚属Massilia和泛菌属Pantoea）的相对丰度与RhizCom相比有所降低（图2f）。这可能归因于某些SbRB在两个微生物组融合后无法在RhizCom中保持类似的丰度。RhizCom与回收群落之间的变化主要归因于相对丰度的变化，而不是类群的丧失（图1b和附表3），这进一步强调了在回收后RhizCom的分类组成总体上保持稳定（图1g）。 小麦根际微生物组与源群落的功能差异 通过宏基因组鸟枪法测序对根际微生物组（RhizCom）、种子携带根际细菌（SbRB）和初始土壤群落进行了功能表征。超过10亿条reads被共同组装成150万条contigs（>1000 bp），总计52亿bp（扩展数据图2和附表4）。基于序列多样性的样本覆盖度显示，RhizCom和SbRB宏基因组的覆盖度接近完全（平均覆盖度>97%），而土壤的覆盖度为>52%，这与土壤序列多样性更高一致（扩展数据图2b）。样本的分类学特征主要由细菌主导（附图5）。其中，变形菌门最为普遍，在RhizCom和SbRB样本中占比超过50%，但在土壤中仅占约20%。总体而言，宏基因组样本的分类学组成与通过16S rRNA扩增子测序获得的结果一致（附图6）。群落在其一般功能含量上存在差异（ANOSIM，P=0.001，扩展数据图3），并且显示出在一般细胞功能（包括遗传信息处理以及碳水化合物和氨基酸代谢）相关基因上的优势。 对群落间KEGG注释的差异丰度进行分析，并将其分类为优势类别，结果显示RhizCom和土壤群落中富集的功能数量相似（分别为1989和2012，图3a）。RhizCom中富集的功能涉及细胞过程（包括运输和分解代谢）和信息处理（图3b）。相比之下，土壤富集在与信号分子和相互作用以及代谢（包括能量代谢、生物降解和外源物质代谢）相关的功能上。SbRB在膜运输方面富集。值得注意的是，跨样本分布平衡的功能的平均丰度高于其他优势类别（图3c和附表5）。某一类群在一个特定群落中的富集并非由该群落中总体丰度的增加引起，而是由于在其他两个群落中丰度较低（图3c）。  图3 | 群落功能贡献 a. 三元图显示每个样本对KEGG功能注释丰度的贡献。每个坐标（以点表示）由每个功能在三元空间中的相对贡献组成。根据样本中的平均TPM（每千碱基转录本数）的log2值对功能进行大小调整。仅考虑平均TPM > 0.5的注释。根据成对差异丰度分析的结果定义的优势类别进行着色。左上角：圆圈和数字表示每个优势类别中的功能数量，大小按比例缩放。右上角：示例，展示如何在三元空间中解释功能贡献。 b. 在每个功能KEGG BRITE层级中，分配给定义的优势类别的注释比例。 c. 每个样本（n = 3个重复）和优势类别的KEGG TPMs的平均值的平方根（sqrt）。统计差异见附表5。 d. 样本富集类别中排名前50的功能的丰度（TPMs）。条形图表示平均值（±标准误差）。黑点表示单个重复值（n = 3）。标注了基因名称或注释。灰色条表示功能未知的KEGGs。附表6提供了所有优势类别的完整信息。 e. 在RhizCom和土壤之间涉及代谢的差异丰度（|log2（倍数变化）|≥2.5且Padj.<0.01）KEGG注释。使用双侧Wilcoxon检验计算统计差异。标注了差异丰度注释的数量，它们在土壤中的值更高，尽管丰度的变化（即，倍数变化）保持相似（P = 0.56）。在箱线图（c、d、e）中，中心线表示中位数，方框跨度为第一到第三四分位数，须线延伸至1.5×四分位距。超出此范围的异常值以黑点表示。小提琴图以核密度估计显示数据分布。 小麦根际微生物组富含与宿主相互作用的特征 在考虑最富集的功能时，铁获取在根际微生物组（RhizCom）和种子携带根际细菌（SbRB）群落中都是一个显著特征（图3d）。RhizCom中富集的功能还包括淀粉和蔗糖代谢、植物定殖以及有益活动（如鞭毛、胞外多糖、氢氰酸和1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶的生物合成）的基因（图3d和附表6）。SbRB中富集的功能包括涉及不同糖类（包括纤维素/半纤维素中间体）的运输和代谢的基因。土壤群落富集在更广泛的底物代谢和能量产生以及芳香化合物的生物降解方面（图3d和附表6）。此外，由于SbRB主要整合到RhizCom中（图2a），我们检查了RhizCom和土壤之间KEGG注释的差异丰度（附表7）。结果强调了RhizCom中涉及生物膜形成、运动性和碳水化合物代谢的基因的富集，而土壤则以涉及广泛化合物的生物降解和代谢的基因为特征（图3e和附图7）。富集的功能在群落内遵循不同的分类学分布（扩展数据图4），反映了每个群落的主要成员。 专门化的种子携带根际细菌（SbRB）代谢促进根际微生物组的组装 对contigs进行分箱和去复制后，总共得到了821个宏基因组组装基因组（MAGs），其中110个为高质量到中等质量（完整性>50%，污染度<10%，图4a）。这些MAGs代表了根际微生物组（RhizCom）的22.2%、种子携带根际细菌（SbRB）的42.8%和土壤群落的8.4%（图4b和附表8）。基于TPMs（每千碱基转录本数）将MAGs分配到其主要群落，结果有60个MAGs被分配到RhizCom，16个分配到SbRB，33个分配到土壤群落（图4c和附表8）。MAGs的分类学分类与每个群落中最丰富的类群相对应。例如，分配给SbRB的MAGs属于泛菌属（Pantoea）、芽孢杆菌属（Paenibacillus）、根瘤菌属（Rhizobium）或假单胞菌属（Pseudomonas）（图4c和图1e）。  图4 | 宏基因组组装基因组的特征 a. 根据完整性和污染度百分比的宏基因组组装基因组（MAG）质量。高质量MAGs：>90%完整性，<5%污染；良好质量MAGs：>75%完整性，<10%污染；中等质量MAGs：>50%完整性，<10%污染；低质量MAGs：≤50%完整性，<10%污染；被丢弃的MAGs：≥10%污染。虚线灰色线表示MAG质量阈值。每个质量类别的MAG数量和百分比在甜甜圈图中显示。 b. 映射到MAGs的总reads数的百分比。未映射和未分类的reads未被考虑用于百分比计算。 c. 高至中等质量MAGs的分类学分类和特征。分类学分类基于通过MAG contig共识获得的最后一个分类学等级。基于最大似然（ML）的系统发育树，扩展了38,640个比对位置，并使用100个快速引导推断，随后进行彻底的ML搜索以找到最佳评分树。由于缺乏足够的标记基因序列进行系统发育推断，7个MAGs被丢弃。菌株异质性。 d,e. 在SbRB MAGs中富集的代谢特征。在果糖和甘露糖以及淀粉和蔗糖（d）或烟酸/烟酰胺（e）代谢类别中的注释数量。中心线表示中位数，方框跨度为第一到第三四分位数，须线延伸至1.5×四分位距。超出此范围的异常值以单独的点表示。 基于KEGG注释，对分配给三个群落的宏基因组组装基因组（MAGs）的功能差异进行了探索。结果表明，SbRB MAGs中淀粉和蔗糖代谢（Kruskal-Wallis检验：P=0.00003）以及果糖和甘露糖代谢（P=0.00019）的注释比例更高（图4d）。此外，涉及烟酸和烟酰胺代谢（P=0.00259）以及核黄素代谢（P=0.00116）的注释数量也更高，这表明SbRB具有专门化的代谢途径。在这些类别中注释数量最多的SbRB属于泛菌属（Pantoea，MAGs M057和M058）、芽孢杆菌属（Paenibacillus，M008）、假单胞菌属（Pseudomonas，M063和M108）和普雷斯特菌属（Priestia，M004），这与其普遍性一致（图1e、扩展数据图5以及附表3和8）。 SbRB MAGs中差异存在的特定反应揭示了它们能够同化特定的细胞外二糖：蔗糖、麦芽糖、纤维二糖和海藻糖，通过将其转化为单糖果糖和葡萄糖（图5）。尽管这些上游途径在土壤群落成员中缺失，但三个群落的MAGs都编码了类似的下游代谢途径（例如，将d-葡萄糖转化为d-果糖-6P，或将d-果糖转化为d-果糖-6P，图5b）（图5c）。分配给SbRB和RhizCom的MAGs显示出类似的上游二糖同化途径的普遍性。这些反应大多被SbRB中最丰富的成员：泛菌属、芽孢杆菌属和普雷斯特菌属所承担。此外，与土壤相比，SbRB MAGs中烟酸和核黄素维生素（分别为B3和B2）的生物合成完整途径更为普遍（烟酸为6比4，核黄素为8比3），这两种途径都存在于泛菌属、芽孢杆菌属、普雷斯特菌属和假单胞菌属的SbRB MAGs中（图5a）。这些结果表明，SbRB在小麦根际启动了二糖的同化作用，随后这些二糖可以被更多的RhizCom成员利用。  图 5 | 种子携带根际细菌（SbRB）对糖类的代谢驱动根际微生物组（RhizCom）的组装 a. 群落的宏基因组组装基因组（MAGs）中涉及特定糖类代谢的主要KEGG反应的分布（蓝色）或烟酸和核黄素维生素的生物合成（绿色）。烟酸：R07407, R00481 + R04292 + R03348 + R03346 + R02295。核黄素：R00425 + R03459 + R03458 + R07280 + R07281 + R04457 + R00066 + R00549 + R00161。 b. 途径中的反应。圆圈代表酶（箭头）代谢的底物和产物。虚线代表可以进入下游分解代谢途径（即糖酵解）的底物。 c. 每个MAG的关键KEGG反应的注释数量以及分配的群落。箱线图下方的数字表示包含该反应的MAG数量。特定二糖（蔗糖、麦芽糖、纤维二糖和海藻糖）的上游分解代谢途径仅存在于SbRB/RhizCom成员中，而不存在于土壤MAGs中，而下游分解代谢途径（R00299, R00028, R00760）则存在于大多数MAGs中。NaN，由于组间变异性不足，未计算P值。中心线表示中位数，方框跨度为第一到第三四分位数，须线延伸至1.5×四分位距。超出此范围的异常值以单独的点表示。 对五种分离的根际微生物组（RhizCom）成员的糖类利用特征进行了表征，包括单培养和共培养。辅助性种子携带根际细菌（SbRB）菌株泛菌属（Pantoea）和芽孢杆菌属（Paenibacillus）使伙伴菌株能够在二糖作为唯一碳源的情况下生长（扩展数据图5）。这种代谢专门化可能解释了它们在根际微生物组（RhizCom）中早期占主导地位的原因，使SbRB能够高效利用发育中的根际生态位中的关键资源，抢先消耗简单的糖类，从而阻止后来者的利用。 Daniel Garrido-Sanz(第一作者)  Daniel Garrido-Sanz 是一位微生物学领域的研究人员，目前在瑞士洛桑大学（University of Lausanne）基础微生物学系担任初级讲师。他的研究主要集中在微生物基因组学、微生物群落结构与功能，以及微生物在环境修复中的应用等方面。 Christoph Keel(通讯作者)  Christoph Keel 是瑞士洛桑大学（University of Lausanne）基础微生物学系的高级讲师（Maître d'enseignement et de recherche）。他的主要研究方向包括微生物学、假单胞菌（Pseudomonas）的生物学特性、植物与微生物的相互作用，以及根际微生物群落的生态学。 翻译：杨海飞，青岛农业大学，基因组所联培硕士在读; 审核：朱志豪，广东医科大学，基因组所联合博士后; 终审：刘永鑫，中国农科院基因组所，研究员/博导; 排版：荀佳妮，中国农科院基因组所，生物信息学硕士在读 |
|
|
