引起下呼吸系统感染的病原谱甚广，包括细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体、立克次体等微生物以及较少见的原虫、吸虫、绦虫等寄生虫多种。虽然细菌和病毒仍认为是呼吸系统感染最常见的病原体，但由于抗菌药物的广泛应用、免疫受损宿主的增加和人口老龄化等导致易感人群结构改变等因素，肺部感染的病原谱已走向多元化。病原学检测技术的发展使得部分以往不易或不能检出的病原体如军团菌、肺炎衣原体等，也变得颇为多见。
肺炎的病原体因宿主年龄、伴随疾病与免疫功能状态、获得方式（社区获得或医院内获得）而有较大差异。社区肺炎的常见病原体为肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、军团菌和病毒等。抗生素广泛应用后，虽然肺炎链球菌所占比例明显下降，但仍然是社区获得性细菌性肺炎最常见的病原体。金黄色葡萄球菌和革兰阴性杆菌在轻、中症肺炎中较少见。如果采用血清学方法检测，则肺炎支原体在轻症肺炎中所占比例可高达13％～37％。尽管病原检测技术已有很大提高，人类对社区肺炎病原谱的了解并不令人满意。在社区肺炎中，即使采用多种检测手段，仍有30％～50％病人不能检出感染的病原体。也有研究表明，常规病原检测阴性的病例，重复检查或采用更敏感的方法，有部分可获阳性结果，最常见仍系肺炎链球菌。表1显示不同病情严重程度的社区肺炎，其病原谱构成可有明显差别
表1 不同病情社区获得性肺炎病原谱构成比较
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轻症（门诊治疗）
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中度（需住院）
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重症（需住ICU）
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护理院获得
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研究病例（论文数）
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439（4）
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5379（10）
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1023（8）
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471（6）
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肺炎链球菌
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5.0(0～14)
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17.3(12.9～35.4)
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21(17～34)
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12.9(1.2～29.7)
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流感嗜血杆菌
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2.3(0～1)
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6.6(4.5～9.5)
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－
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6.4(0～15.0)
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卡他莫拉菌
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－
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－
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－
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1.5
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金黄色葡萄球菌
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－
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2.9(1.1～3.6)
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7.4(0～13.7)
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6.4(0～21.0)
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军团菌
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－
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1.3(0.8～3.7)
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5.8(2.6～17.7)
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－
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其他革兰阴性杆菌
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－
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4.1(1.8～5.5)
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8.8(3.3～17.8)
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15.2
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肺炎支原体
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24(11～38)
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13.7(1.2～17.6)
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－
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－
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肺炎衣原体
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－
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10.1(0～17.6)
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－
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0.4
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不明
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48(38.6～56)
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－
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35.6(27.5～42.9)
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51.0(13.6～85.0)
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* 表中括号内数字为95％CI
随着对非典型病原体的认识及检测方法的改进，其检出率在不断增高，非典型病原体在社区获得性肺炎中的地位逐渐受到重视，并成为引起CAP的前几位的病原体。非典型病原体在CAP中的比例大约有10％～30％，也有更高的结果。肺炎支原体感染常常被认为在院外病例多于住院患者，然而最近研究表明住院患者中肺炎支原体感染也是很高的达到17％～37％。Bochud等对170名CAP非住院患者调查发现肺炎支原体感染为14％，肺炎衣原体5％，肺炎链球菌21.8％。另外对于非重症CAP年龄小于50岁患者研究发现肺炎支原体感染有40％。嗜肺军团菌感染占CAP的0.5％～6％，病死率为5％～25％，是需入住ICU的重症CAP的比较常见的致病菌。肺炎衣原体抗体在20岁青年中有50％人群可以检测到，而老年人中有75％抗体阳性，肺炎衣原体感染多发生在有合并症的老年人。CAP中肺炎支原体的比例占到5％～15％，西班牙调查结果显示肺炎衣原体为13％，肺炎支原体为22％。日本数据为肺炎支原体占9.5％，肺炎衣原体为7.5％。在美国[29]对2776例CAP的病原体研究中肺炎支原体比例最高达32.5％，肺炎衣原体为8.9％。
在我国目前缺少有关CAP病原体的流调资料，我们进行的全国成人CAP流调结果显示肺炎支原体比例最高，可达38.9％左右，肺炎衣原体有11.4％左右，嗜肺军团菌4％。这与国外相关报道结果相似，同时表明肺炎支原体在我国CAP中占有很大比例。
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造成肺炎病原菌诊断困难的原因是什么？有什么解决方法吗？
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但是对于不同的研究，诊断非典型病原体的方法和标准是不同的，这造成了数据上很大的差异，而且非典型病原体的诊断多采用血清抗体测定，第二份血清的采集时间、不同地区间流行病学的差异，均可以导致判断标准的不同，影响最终结果。为了更统一非典型病原体的诊断，美国IDSA在2003对CAP指南进行修订时特别强调了肺炎衣原体和嗜肺军团菌的诊断方法。肺炎衣原体建议采用微量免疫荧光法（MIF）检测血清抗体，或组织培养，或PCR检测呼吸道分泌物。嗜肺军团菌建议尿抗原测定和呼吸道分泌物培养。
近年来，现代分子生物学技术越来越多地应用于临床微生物的检测，又发现了一些过去未识别且在人工培养基难以生长的与肺炎相关的胞内菌病原体被发现。如军团菌样阿米巴致病菌（Legionella-like amoebal pathogens，LLAPS）、Afipia菌、Candidatus Odyssella thessalonicensis、衣原体样胞内菌（Chlamydia-like endosymbionts）和人偏肺病毒（human Metapneumovirus hMPV）、SARS冠状病毒等。这些病原体均在CAP的病原体构成中占有一定的比例，并且其地位受到越来越多的重视。
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肺炎链球菌对三大类抗生素耐药性逐年升高，目前形势怎样？如何预防新的耐药产生？
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二、常见病原体耐药现状
1.肺炎链球菌对常用抗生素的耐药
肺炎链球菌是CAP的最主要病原体，也可以导致中耳炎、化脓性脑膜炎和鼻窦炎等，长期以来青霉素一直作为治疗肺炎链球菌感染的首选药物。自从1965年美国波士顿首先报道了耐青霉素的肺炎链球菌（Penicillin Resistant Streptococcus Pneumoniae, PRSP）后，耐药菌的报道相继在世界各地出现，世界上有关细菌耐药检测网的数据表明肺炎链球菌耐药性在世界各地逐年升高，其中又以亚洲最为严重。
（1） 肺炎链球菌对β－内酰胺类抗生素的耐药
继PRSP在1965年从波士顿发现，1967年澳大利亚一位支气管扩张患者痰中分离出PRSP，1977年南非报道了青霉素MIC值达4～8ug/ml的肺炎链球菌临床分离株。20世纪80年代后，PNSSP在世界范围内广泛流行，在美国PNSSP从1980年的4％上升到1998年的35％。
1992年首先在欧洲和美国开展的Alexander项目，是一个持续性检测研究，主要监测社区获得性呼吸道感染的病原体对抗生素的敏感性，在1996年监测中心扩大到亚洲和非洲等多个国见，结果显示，1992年～2000年肺炎链球菌对青霉素的耐药率逐渐上升，1996年数据显示PRSP为10.4％，到1997年为14.1％，1998年～2000年的分离株为18.2％。1997年时PNSSP在西班牙为51.4％，法国49.7％，德国14.5％，英国12.6％，美国33.9％，墨西哥49.2％，南非30.3％。
另外一项对全球细菌耐药性进行监测的SENTRY结果也反应了同样耐药趋势，SENTRY抗生素监测项目开始于1997年，主要监控CAP和医院获得性肺炎（NP）的病原体耐药性，包括多个地区如美国、加拿大、欧洲、拉丁美洲和亚太平洋地区。其数据表明在1997年～1999年分离菌中PRSP比例在亚太地区最高为17.8％，美国14％，拉丁美洲11.7％，欧洲10.4％，加拿大只有6.8％[34]。而到2000年北美洲的监测数据显示PNSSP已经达到32.1％。
亚洲耐药病原学监测网（ANSORP）1996～1997年数据表明22.7％的肺炎链球菌为PRSP，18.3％为PISP，只有59％为PSSP。其中韩国耐药率最高达79.7％，日本65.3％，越南60.8％，泰国57.9％，香港地区61.1％，中国大陆9.8％，印度3.8％。
肺炎链球菌对其它β－内酰胺类抗生素的耐药率也呈上升趋势。1997年Alexander监测资料显示肺炎链球菌对β－内酰胺类抗生素的耐药率为：氨苄西林24.3％，阿莫西林15.7％，阿莫西林/克拉维酸15.8％，头孢克洛24.3％，头孢呋辛19.2％，头孢曲松15％。美国1997～1998年监测显示的耐药率为：阿莫西林/克拉维酸16.7％，头孢呋辛26.5％，头孢曲松12.2％，而PRSP对以上三种药物的耐药率为92.7％、99.1％、78.6％，呈显著的交叉耐药现象。
（2） 肺炎链球菌对大环内酯类药物的耐药
肺炎链球菌对红霉素耐药在20世纪70年代相对少见，但随着大环内酯类抗生素被推荐作为治疗CAP的一线药物，用量的增加使得对大环内酯类耐药的肺炎链球菌在世纪各地迅速增加。1997年Alexander监测资料显示肺炎链球菌对红霉素的耐药率为：法国45.9％，西班牙32.6％，意大利29.8％，美国16.9％，墨西哥15.9％，南非7.6％，香港地区77.8％。ANSORP的1996～1997年数据表明肺炎链球菌的红霉素耐药率为韩国80.8％，日本75.6％，新加坡28％，中国大陆32.25％，马来西亚3％。由于大多数大环内酯类抗生素具有相似的化学结构和作用机制，因此肺炎链球菌在对红霉素产生耐药的同时，也可对阿奇霉素、克拉霉素等新型的大环内酯类抗生素产生交叉耐药。
大环内酯类抗生素的作用机制是通过与细菌核蛋白体50S亚基结合，抑制肽转移酶活性，从而抑制蛋白质合成。肺炎链球菌对大环内酯类抗生素的耐药表型可以分为M型和MLSB型。对14和15环大环内酯类呈低水平耐药而对16环大环内酯类、林可酰胺类和链阳霉素B敏感的肺炎链球菌称为M型。对大环内酯类、林可酰胺类和链阳霉素B呈现交叉耐药的称为MLSB型。根据表达方式的不同，MLSB型耐药又可以分为内在型（cMLSB）和诱导型（iMLSB）耐药，诱导型耐药仅表现为对大环内酯类低水平耐药，一旦耐药基因被完全诱导表达则表现为内在型耐药，即对所有大环内酯类、林可酰胺类和链阳霉素高水平耐药。大多数菌株的耐药表型为cMLSB
（3）肺炎链球菌对氟喹诺酮类药物的耐药
呼吸氟喹诺酮类药物对耐药的肺炎链球菌推荐作为首选药物，从目前监测数据看来其耐药率还很低，但也有增加趋势，新出现的耐氟喹诺酮类药物的肺炎链球菌正给我们敲响警钟。1997年Alexander监测资料显示肺炎链球菌对氟喹诺酮类耐药率仅有0.3％。美国1997～1998年监测显示的左氧氟沙星耐药率为0.2％。加拿大肺炎链球菌对环丙沙星耐药率由1996年的0％增加到1998年的1.7％，香港报道耐药率环丙沙星12.1％，左氧氟沙星5.5％。由于呼吸氟喹诺酮类药物对常见的呼吸道致病菌和非典型病原体都有很好的杀灭作用，现在门诊处方量正在逐步增加，在这种药物大量使用的选择压力下，越来越多的耐药株将会被筛选，因此如何更加合理的使用这种有很好疗效的药物，延长氟喹诺酮类药物的使用“寿命”，减慢耐药肺炎链球菌产生的“步伐”是我们作为临床医生应该进一步思考的问题。
2.流感嗜血杆菌的耐药
自1973年美国首先发现流感嗜血杆菌对氨苄西林耐药以来，耐药率不断增加，西方国家报道可达45～50％，在我国目前总体尚不高，但部分大城市可达20％左右。耐药机制主要是产TEM-1型和ROB-1型β－内酰胺酶，广谱青霉素联合酶抑制剂复方制剂仍然敏感。除了产酶外，流感嗜血杆菌尚有β－内酰胺酶阴性耐氨苄西林，机制为青霉素结合蛋白靶位改变或膜通透性降低，除了日本外，次种耐药相当少见。
3.卡他莫拉菌的耐药
卡他莫拉菌产β－内酰胺酶菌株达90～100％，主要对青霉素耐药，对含有β－内酰胺酶的抑制剂复方制剂仍然敏感。
三、病原学诊断方法及评价
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提高咳痰标本诊断准确性的方法有哪些，应注意哪些问题？
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1．咳痰标本
在鉴定下呼吸道感染病原体时，咳出的痰液（简称咳痰）标本虽然应用最早而且目前仍然十分广泛，但也是最受争议的微生物学标本。
（1）指征 凡有痰液的下呼吸道感染患者均可采集此类标本进行涂片（革兰染色等）和培养检查。可用于普通细菌、分枝杆菌、真菌和军团菌的检测，但不适于检测厌氧菌。
（2）方法 为提高实验室诊断的准确性，建议在抗生素应用前采集痰标本，并且在采集标本的过程中要有专业的医务人员指导。在获取标本前，应该摘去牙托，清洁口腔如刷牙和漱口。无痰或痰量极少者可用3％～5％氯化钠溶液5ml雾化吸入约5min进行导痰。氯化钠浓度过高，病人常常不能耐受。气道高反应如哮喘病人则不宜采用此法。也可采用物理疗法、体位引流、鼻导管抽吸等方法获取痰液。除部分呼吸道病毒和新生儿沙眼衣原体外，从咽后壁或鼻咽部采集的痰液进行病原学检测常无意义。标本采集后1～2h内必须立即进行实验室处理，室温下延搁2h会降低肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等苛养菌的分离率，而定植于上呼吸道的非致病菌以及许多条件致病菌如铜绿假单胞菌等革兰阴性杆菌则过度生长。
对于普通细菌性肺炎，痰标本送检每天1次，连续2～3天。不建议24h内多次采集痰标本送检，除非痰液外观性状出现改变。怀疑分枝杆菌感染者，应连续收集3天清晨痰液送检。而对怀疑军团菌或深部真菌感染，痰标本理想的送检次数尚无定论。
所有标本应置于适当的容器，并在申请单上提供必要的信息，如标本采集日期和时间、申请特殊染色如军团菌的直接荧光抗体（FA）染色、抗酸染色、KOH制片查真菌和类圆线虫湿片检查，培养类型如细菌、分枝杆菌和真菌。
（3）评价 痰标本采集方便、易行，对病原学诊断具有重要价值，但由于咳痰受到口咽部定植菌污染，分离到的细菌往往不能真正代表下呼吸道感染的病原菌。痰培养结果的解释应结合临床表现、痰液直接镜检、细胞学筛选、定量或半定量培养以及所发现的微生物的致病力等，综合考虑。雾化吸入引导的痰液（induced sputum)标本，简称导痰，实验室处理和临床意义评价同咳痰。
2．经气管穿刺吸引物
经气管穿刺吸引（transtracheal aspiration,TTA）技术创立于1959年。由于采集到的下呼吸道标本不受上呼吸道正常菌群污染，曾较广泛推荐应用于下呼吸道细菌性感染的病原学诊断。
（1）指征 下呼吸道普通细菌、厌氧菌感染的诊断与鉴别诊断。开展该技术应具备：①有专业操作人员；②细菌病原体可疑或待排除；③患者病情严重，做此检查利大于弊；④无禁忌征；⑤侵入性更小的检查没有结论或不能采用；⑥实验室的操作规范，可快速处理送检标本；⑦尚未用过抗生素，以避免结果假阴性。
（2）禁忌证 严重咯血、出血素质、患者不能配合、严重的低氧血症和近期使用过抗生素。以上所列都是相对禁忌症，但作为常规指南，要求患者血小板计数不少于100,000/mm3，凝血酶原时间不少于对照组的60%，其它出血参数无严重障碍，PaO2>60mmHg。儿童气道直径小，而且不合作，也列为禁忌。
（3）方法 患者仰卧位，颈部后伸。呼吸困难和低氧患者应给予鼻导管吸氧。将甲状软骨下缘和环状软骨可触摸到的切迹处皮肤消毒后，用含有肾上腺素的2％利多卡因局部浸润麻醉，有助于止血。用带有20～30cm长度聚乙烯管和14号钢针的静脉内插管装置穿透环甲膜（为顺利进行，可先在局部皮肤切一小口），并使针孔斜面向上，钢针向前进几毫米就进入气管，千万不要损伤气管后壁。保持钢针一定倾斜度，使导管从尾部插入到气管中去。将导管尽量往前送入气管，下插至隆突水平，退出钢针。用20～30ml注射器连接导管抽吸下呼吸道分泌物。向气道内注入不含抑菌剂的生理盐水虽可有利于标本的采集，但应尽量避免，因为这会稀释标本，使细菌的半定量培养失去意义。送检的标本只需数滴分泌物。可置于注射器、厌氧运送瓶或Luken收集器中送入实验室快速处理。导管拔除后，应在钢针穿刺部位加压数分钟。术中或术后的咳出物均被认为等同于“支气管镜检术后的标本”，可送细胞学检查或分枝杆菌培养。
（4）并发症 对患者来说，TTA检查令人不适，主要原因在异物在下呼吸道中产生不愉快的感觉。并发症可分为三类：第一类是穿刺部位的副反应，如局部出血、气管后壁刺伤、皮肤或气管旁脓肿、可延至面部或纵膈的皮下气肿、甚或导致气胸；第二类是低氧血症、或由于下呼吸道中导管引发阵发性咳嗽而导致的严重咯血，肺部有出血灶的患者较为常见；第三类是血管-迷走反射，当并发低氧血症，可导致心率失常、低血压和心肌缺血。术后监护提示心脏并发症时，可使用阿托品。致死等严重并发症也有报道。
（5）评价 由于通常喉水平以下呼吸道是无菌的，故TTA可免受上呼吸道细菌污染。如果患者术前未接受抗生素治疗，实验室又是正确地处理了标本，那么下呼吸道细菌感染患者的TTA标本几乎全部都能被检测出致病菌。在这些条件下，假阴性率只有1％，而假阳性率较多，尤其在未进行定量培养时。一般认为TTA敏感性较高，但特异性欠佳。绝大多数引起感染的病原菌在初始分离培养基上大量生长，最少也应呈中等程度生长。如果生长不好、或只在肉汤中生长、或有念珠菌生长，那么在解释结果的时候就要慎重了。患有慢性肺部疾病、支气管新生物或慢性误吸的患者，尽管其TTA标本中细菌大量生长，在评价结果时仍要注意。定量或半定量培养可区分大部分存在于下呼吸道隆突以上的低浓度定植菌所造成的假阳性。但是慢性支气管炎患者下呼吸道可有浓度超过106CFU/ml的细菌定植，包括可能致病的肺炎链球菌和流感嗜血杆菌，结果很难评价。值得指出的是，TTA创伤性较大，近年来临床上已被其他较为安全的下呼吸道采样技术如防污染套管毛刷所取代。
3．经胸壁针刺吸引物
经胸壁针刺吸引（Transthoracic Needle Aspiration, TNA）是在19世纪后期形成的，最初用于诊断肺部可疑恶性肿瘤。20世纪30年代，由于微生物学研究的发展而得以普及。当时，临床上要求对肺炎链球菌进行分型以指导抗血清治疗，但后来抗生素的应用使这种精确的微生物诊断要求大大缩减。在近30多年来，TNA技术又引发了专家们的兴趣，主要原因仍在于依靠它可以使一些恶性肿瘤得以确诊，而对于感染性疾病，只是偶尔用来诊断一些原因不明的肺炎（尤其在儿童）和免疫缺陷患者的肺炎或贴近胸壁的肿块病灶的标本采集。该技术的主要变动在于获取标本所选用的方法以及针头的尺寸大小，如1974年引进的skinny针头到Turner-Wescott针头。组织活检针头如Vim Silverman针头、Cope针头和环钻等由于易引起并发症，已遭淘汰。
（1）指征 TNA标本可用于检测由需氧或厌氧细菌、分枝杆菌、病毒、真菌、军团菌和寄生虫等引起的感染。其特点在于获得的标本还可用于细胞病理学或组织学检查，有助于非感染性疾病的诊断。TNA主要指征：①进行性恶化的不明原因肺部感染或疗效不佳的肺部感染，而且仅靠非侵入性检查不能明确诊断者；②非感染性疾病（如肿瘤等）可疑患者，同时又不能排除感染性疾病者。
（2）禁忌证 包括不可逆出血素质、肺大泡、呼衰患者接受机械通气、可疑血管损害、疑似包虫病、对侧肺切除者。相对禁忌症包括患者不能配合、顽固性咳嗽、肺功能储备有限、肺动脉高压和大血管周围病变等。
（3）方法 根据胸部X线检查对小结节病灶或靠近心脏、大血管的浸润灶定位，将细针刺入受累区域。对弥散性肺病患者，腋中线是通常选用的穿刺部位。操作最好在电透定位下进行，对于过小的病灶也有采用CT导引方法。可选用的多种针头如23号或25号的skinny针头，16-22号的spinal针头或大孔的Turner-Wescott针头。Skinny针头很少引起并发症；而Turner-Wescott针头取到的标本很大，可做组织学检查。在穿刺过程中，应嘱患者屏住呼吸，在选用skinny针头时，则可不必屏气。针吸方法包括：①在穿刺和退针时连续抽吸；②只在退针时抽吸；③在“来回”运动中，施加负压；④注入液体如不加防腐剂的盐溶液；⑤或将吸引物注入肉汤培养基。因为得到的标本通常都很少，标本应仔细分送进行恰当的微生物染色检查和培养，以及细胞病理学或组织学检查。建议吸引标本床旁接种。
（4）并发症 TNA技术并发症的发生率取决于操作人员、患者的相关情况和使用的针头尺寸。近年倡导细针穿刺后并发症减少。气胸是最常见的并发症，约有15％～30％的患者发生，6％～20％气胸需要胸腔插管。咯血发生率可达10％，多为自限性。空气栓塞罕见，肿瘤或感染的局部扩散或播散也罕见。
（5）评价 与其他侵入性检查相比，TNA特异性较高而敏感性相对较差。假阳性率为2％～20％，通常为被皮肤的菌群所污染，容易鉴别，因为这些菌生长浓度低或只在肉汤中生长而分离平板不生长。据报道，在青霉素发现前伴有菌血症的肺炎链球菌肺炎经TNA获取的标本，其培养的假阴性率可达20％。TNA在儿童肺炎诊断阳性率为40％～60％，非AIDS免疫抑制宿主肺炎LA培养阳性率为56％～77％。
4．经支气管镜采样
纤维支气管镜（简称纤支镜）检查可直接从肺部感染灶获取支气管分泌物，操作较为安全。在过去二、三十年中，其应用面得到快速发展，其中之一是用于检测痰标本中难以明确的一些不常见的病原体，尤其在免疫缺陷患者。
（1）指征 支气管镜检查技术需要专业人员操作，费用昂贵，采集到的标本常被上呼吸道菌落污染，又偶伴有并发症，所以，对极大多数下呼吸道感染患者采用该技术并不可取。但对非寻常感染如慢性、难治性感染，或免疫抑制患者感染且不能用咳痰、导痰等标本检测出病原体时，可选择应用。临床上，有许多患者因其它的原因接受支气管镜检查，只有当感染被作为需要鉴别的疾病时，获取的标本才送检微生物学实验室。许多专家建议，对于不能咳出或诱导出足够的痰液患者，支气管镜检查可作为获取标本进行分枝杆菌培养的一种方法。目前，支气管镜检查在检测吉氏肺孢子虫、某些机会性致病真菌（不包括念珠菌）、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、军团菌和分枝杆菌等感染时有显著的优点；获得的外周肺组织病灶标本也可用于组织学检查。但值得注意的是，在培养普通细菌时，通过支气管镜检查获取的吸引标本，并不优于细胞学筛选认为可接受的咳痰标本。通过下面介绍的方法可提高经纤支镜采集的标本质量，可用于普通细菌培养。经支气管活检对吉氏肺孢子虫感染的诊断率可达90％以上，但对其它病原体感染，其确诊率明显低于开胸肺活检（OLB）；与OLB相比，经支气管活检术获取的组织太小，不能做冰冻切片检查；而且由于操作不是在直视下进行，标本有可能来自非感染病灶区域。
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在支气管镜检查中有哪些技巧可获得高质量的采集标本，提高病原菌诊断准确性？
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（2）方法 术前应做肺功能和凝血功能检查。术中患者应保持固定体位，可经鼻或口腔插入支气管镜。选用利多卡因采用喷雾或局部浸润进行局部麻醉。局麻药具有抗菌和抗分枝杆菌的特性，但迄今的研究资料表明，在采集后1～2h内处理标本，局麻药并不影响绝大多数微生物的检测。常用采用方法有经纤支镜吸引、支气管肺泡灌洗、防污染毛刷采样和防污染支气管肺泡灌洗等。
（3）并发症 支气管镜检查的并发症包括血管-迷走神经反射，术前使用阿托品可预防；由硫酸吗啡和其它麻醉前用药引起的呼吸抑制；PaO2降低，平均下降10～20mmHg；心脏和中枢神经系统并发症；出血过多；术后发热和肺部感染；菌血症（极少发生）和气胸的发生。报道的死亡率为0.015％。
（4）评价 由于方法和应用目标存在明显差异，故将微生物学标本分为两类叙述。
1）检出的微生物不存在解释困难问题，尽管这些标本同样存在被上呼吸道菌群污染。相关微生物包括致病菌和一些机会性致病真菌、寄生虫、病毒、军团菌和分枝杆菌等。通过采集多种标本如经支气管肺活检、支气管灌洗和刷检等，可提高微生物的检出率。凝血功能异常和需机械通气支持是经支气管活检的相对禁忌症。
在支气管肺泡灌洗（Bronchoalveolar lavage, BAL）之前，应在纤支镜下对整个气管-支气管树做全面检查，然后取出支气管镜，冲洗镜身上的分泌物后再次重新插入，嵌入舌叶或右中叶支气管或者局部受累的节段。如果支气管镜的先端嵌入不够紧或灌洗液回流不理想，反映所得到的标本只是支气管的冲洗液，并非肺泡灌洗液，而肺泡才是吉氏肺孢子虫富集的部位。通过三腔活塞管在抽吸处注入20ml等渗盐水，当盐水滴注完毕，用50～100mmHg的负压抽吸收集灌洗液。反复5次，灌入总量100ml，收回40～70ml灌洗液。BAL没有OLB和经支气管活检那样具有创伤性，并发症少见。
送检需氧菌、军团菌、奴卡氏菌、真菌、分枝杆菌和病毒，约需15ml BAL液。其余的BAL液在低速离心下，可沉淀出细胞成分；细胞经不含镁、钙的无菌缓冲盐水悬浮和洗涤两次后，将细胞沉积物用盐水把浓度调整为2.0 x105/0.2ml，然后在500×g的离心力下于玻片上制成细胞离心标本。细胞学检查推荐方法见表2。
表2 BAL离心沉淀物细胞学检查推荐方法
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微生物
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涂片数量
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染色方法
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细菌
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1
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革兰染色
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军团菌
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5
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荧光抗体染色
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真菌
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2
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Gomori乌洛托品银染色，湿片检查
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分枝杆菌
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3
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抗酸染色
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病毒
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含单克隆抗体染色测CMV、HSV等
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吉氏肺孢子虫
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3
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Gomori乌洛托品银染色
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BAL标本可以用直接免疫荧光法快速检测出下呼吸道的病毒感染。单克隆抗体的免疫荧光法可检出该细胞离心标本涂片的巨细胞病毒感染，从理论上说，在细胞离心制作标本的玻片上，各个细胞应完整地呈单层状铺布，但事实上，几乎不可能发生；玻片上的破裂细胞和碎屑常干扰荧光，造成误判。因此，另一种更为可取的方法是将BAL液接种到含单层成纤维细胞的玻璃容器中，随后用单克隆抗体染色，16h后荧光检测,可显著提高检出率。另外，BAL液还可用来检测单纯疱疹病毒和流感病毒感染。
普通的支气管吸引，即插入纤支镜抵肺炎病灶引流支气管内，依次连接标本采集瓶或试管及负压吸引装置，用负压将下呼吸道分泌物吸入标本采集瓶内送检。此法虽然简单，但对检出上述病原体远不如BAL。
2) 包括送检细菌的所有标本，这些细菌通常是上呼吸道正常菌群的组成部分。对下呼吸道感染的可疑患者，提倡做细胞学筛选和涂片革兰染色。纤支镜检查标本还没有像咳痰那样进行大量研究来证明其有效性。这些标本可与咳痰标本相似的方法进行培养。因为受到上呼吸道菌群的污染，不可以作厌氧菌培养。
近20年来一种被称为防污染样本毛刷（Protective Specimen Brush, PSB）可避免上呼吸道菌群污染的采样工具已广泛接受。PSB构造为尼龙刷外套双层塑料管，外套管远端用聚乙二醇作塞封口。纤支镜在直视下抵达脓性分泌物区域或X线异常叶段的支气管口。插入过程尽量不作吸引或向腔内注射粘膜麻醉药。PSB经纤支镜插入并超越先端1～2cm，用内套管顶去聚乙二醇塞、越过外套管约2cm，随后将毛刷伸出内套管约2～3cm刷取分泌物。依毛刷、内套管顺次退回外套管内，然后拔去整个PSB。采样后的PSB用酒精消毒外套管，以无菌剪刀剪去内、外套管顶端部分，然后前伸毛刷并将其剪下至装有无菌林格氏乳酸盐溶液（不含防腐剂）的带螺旋帽的玻璃瓶中，再用力晃匀玻璃瓶，从中取0.1或0.01ml液体接种到常规培养基上，进行需氧和厌氧菌培养。培养出细菌浓度达103个/ml以上（林格氏液），即原始下呼吸道分泌物中细菌浓度相当于106个/ml,可判定为有“意义”。
PSB技术对细菌性肺炎病原学诊断具有较高的敏感性（70％～100％）和特异性（60％～100％）。在操作中，重要的步骤包括：局麻时应采用利多卡因喷雾法而不是腔内注射、标本收集之前要避免吸引、患者保持头低位，定量培养则是此技术的关键。支气管镜检查操作医生必须严格遵守操作规程。同时，还应设置质量控制的内部标准。
近年来对BAL在普通细菌引起的下呼吸道感染的诊断价值有了新的认识和评价。BAL除了用于机遇性感染以检测不定植于上呼吸道的病原体如肺炎支原体、军团菌、分枝杆菌、巨细胞病毒、吉氏肺孢子虫以外，多数作者认为BAL对于细菌性肺炎也不失作为病原学诊断的重要采样技术之一。有研究表明定量BAL培养的敏感率和特异性高，检测细胞内病原菌的特异性高达89％～100%。结果的差异是由于研究的人群不同，检测前服用抗生素和采用的参照试验不同而造成的。从感染部位采样范围看，BAL要比PSB广，即BAL的采样敏感性较好。BAL液经过离心还可作细胞成分分析，若鳞状上皮细胞≤1％可作未受明显污染的“合格”标本。中性粒细胞＞80％，特别是发现细胞内细菌可判断为肺部细菌性感染。研究表明，如果BAL液细胞成分涂片的革兰染色结果阳性，且每个油镜下显示一种或多种微生物，那么该标本培养肯定阳性。定量细菌培养可区分污染菌和病原菌，但划界浓度尚不统一，103～105CFU/ml均有报道。
5．开胸肺活检组织标本
当其它方法不能确诊时，开胸肺活检（Open-Lung Biopsy，OLB）是快速诊断肺部感染最有效的方法之一。主要特点是：①组织既可送检病理检查，还可做微生物学检验；②直视下在病灶组织处取样；③标本体积可相对较大，允许做多种检查；④可保证对大多数患者快速做出诊断，避免了其它检查引起的诊断延误或不能诊断。
（1）指征 对肺部感染患者而言，实施OLB的最主要适应症是肺部感染极其严重，并危及生命，而其它的检查手段仍不能确诊病原体。OLB主要用于免疫缺陷患者，但对确诊免疫功能健全患者的肺部病变也有帮助，尤其是那些慢性疾病或抗生素治疗无反应者。大多数可疑感染患者都接受了经验性抗生素治疗，虽然此并非OLB的禁忌，但抗生素应用必然会明显影响敏感病原菌的检出。
（2）方法 患者在全麻下接受局部胸廓切开术。术中可从受累肺组织切取3～4cm大小的标本。手术持续约30min，术后还应在胸膜腔留置引流管，24h后拔除。
（3）并发症 并发症发生率约13％。严重低氧血症或肺部病灶广泛者出现并发症的危险性较更。最常见的并发症按递减顺序排列，依次为气胸、胸腔积液或脓胸、液气胸、血胸、皮下气肿和创伤性血肿。据报道，并发症的死亡率小于1％。
（4）评价 最大缺陷就是需要进行全身麻醉及实施胸廓切开术。接受OLB患者的病情通常系威胁生命的肺部疾病，所以禁忌症是相对的。认为病情太重不能耐受OLB的想法并不妥当，因为对这些重症患者而言，接受OLB后，通过明确诊断和随之的针对性治疗，获益巨大。出血倾向者术后有出血危险，但由于OLB术中可以采取直接措施止血，所以和其它侵入性检查手段相比，这并不成问题。
6．经人工气道吸引物
人工气道是肺部感染的常见易感因素。经人工气道吸引的分泌物（endotracheal aspirates，ETA）是目前临床较常用的微生物检验标本。但由于这些宿主的气管纤毛粘液防御机制受到损害，大气道常有致病菌或条件致病菌定植而不再保持无菌状态，故建立人工气道患者肺部感染病原学诊断有时更为困难。甚至有一些学者提出ETA做细菌培养前也应该像咳痰标本那样先作细胞学筛选。通常认为ETA的细菌浓度≥105CFU/ml可认为是感染病原菌，而浓度≤104CFU/ml则认为是污染菌。但我们观察发现气管切开套管与经口腔或鼻腔气管插管对下呼吸道防御机制损害不尽一致，前者下呼吸道细菌定植通常较后者明显为少，作病原学诊断分析时值得注意。
7．胸水
肺炎患者伴发胸腔积液比较常见，约占10%～50%，但通常液量较少。虽然多数胸水不能发现细菌，但因为胸水系无污染的微生物标本，如出现阳性培养结果，则对临床治疗有着非常重要的指导意义。
（1）指征 对大多数伴有胸腔积液的肺炎，无论确诊与否，应该行胸腔穿刺术采集标本。如胸水量大，胸穿又同时是一种治疗手段。对有出血倾向或凝血异常者，禁忌此项操作。对肺功能储备差且不能耐受气胸的患者，除非准备全套支持设备并且基础疾病稳定，否则也不宜进行此检查。
（2）方法 患者通常取坐位，上身挺直，用肘靠在一支撑物上，身体稍前倾。对穿刺处皮肤消毒并行局部麻醉后，取一连接50ml无菌注射器的14号标准钢针在存在积液区域的腋后线最低位肋骨的上缘刺入。抽取的液体量不定，一般送检的胸水为10～40ml，而治疗性穿刺则尽可能抽完胸水，但是为了防止出现肺水肿，单次抽液不宜超过1000～1500ml。可余留部分胸水以便日后的胸膜活检。对少量或局限性胸腔积液，或量大但用常规方法很难抽出的胸腔积液，可在超声引导下行穿刺。胸水可封闭在注射器中或注入一厌氧容器并迅速送到微生物实验室检验，同时还应提供相关信息，如操作的日期和时间、需要进行的染色和培养类型。胸腔积液或脓胸均应做厌氧培养。此外，还应做其它检查，包括分类细胞计数和pH测定，腺苷脱氨酶（ADA）测定对鉴别结核胸膜炎具有较好价值。国外一些实验室还提供特殊的胸水抗原检测用于疾病诊断，如流感嗜血杆菌b型、肺炎链球菌、军团菌或新型隐球菌，我国则很少开展。
（3）并发症 最常见的并发症是气胸，发生率可达5％。有建议胸穿后进行常规X线检查。罕见的并发症有严重出血、支气管胸膜瘘或误刺入邻近器官。
（4）评价 胸水是无污染标本，不论被检测出的微生物数量多少，都被认为是病原体。近年来不少作者建议同时将5～10ml的胸水直接注入血培养瓶内送检，可提高细菌检出率。有时一些来自皮肤的非致病菌，如表皮葡萄球菌、类白喉杆菌、痤疮丙酸杆菌可污染胸水标本，但分离出的量很少。经胸腔留置导管采集的胸水标本，细菌培养也可分离出某些微生物，它们可能只是定植于胸腔引流管，并不引起疾病，应注意鉴别。
8．血液
血培养是一种简单易行的肺部感染病原学诊断方法。由于细菌培养阳性率相对较低，故常被临床忽视。有报道肺炎伴发菌血症机会5％～10％，重症和免疫抑制患者则较高。血标本采集方便、安全，且污染机会少、特异性高，它们在病原学诊断上具有特殊意义。肺炎患者血培养和痰培养分离到相同细菌，该菌可确定为肺部感染的病原菌。如仅血培养阳性，但不能用其他原因如腹腔感染、静脉导管解释菌血症的成因，血液中所分离的细菌亦可认为是肺部感染的病原菌。因此，对重症特别是免疫抑制宿主肺炎，应尽早、多次采血作细菌和真菌培养。
9.血清学方法
血清学检查通常用于检测非典型病原体如肺炎支原体、肺炎衣原体、军团菌，以及巨细胞病毒、分枝杆菌，对普通细菌价值不大。常用方法有间接免疫荧光试验（IFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射免疫法（RIA）、免疫电泳、凝集试验等。实验室检测非典型病原体比较棘手，或是敏感性、特异性差或是费时。另外，对大多数血清学检查而言，只有当恢复期的血清IgG抗体滴度高于急性期的4倍时，结果才有意义，不能对疾病做出早期诊断，无益于临床治疗。常见的诊断方法的敏感性和特异性见表3，因此，对疑似非典型病原体引起的社区肺炎，ATS和IDSA都建议经验性治疗。血清学方法对肺部感染的流行病学调查则意义较大。近年来正在发展CAP的抗原监测，特异性高，但敏感性尚欠理想（表4）.
表3 CAP的血清学诊断
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病原体
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结果判断
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敏感性（％）
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特异性（％）
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嗜肺军团菌
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4倍增高或滴度≥1:256
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40～60
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96～99
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肺炎支原体
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CF 4倍增高
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30～70
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>90
|
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特异性IgM
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75～90
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>90
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冷凝集≥1:64
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50～60
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肺炎衣原体
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CF 4倍增高或滴度≥1:64
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10～100
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MIF 4倍增高或IgM≥1:64,
或IgG≥1:512
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40～95
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>80
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CF 补体结合（试验） MIC 微量免疫荧光（试验）
表4 CAP的抗原检测
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病原体
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标本
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敏感性（％）
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特异性（％）
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肺炎链球菌
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痰液
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42～90
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73～100
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血清
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9～62
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>90
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尿
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0～58
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>90
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嗜肺军团菌
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痰液、支气管肺泡灌洗液
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22～75
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>90
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尿
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55～90
|
>95
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病毒
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咽拭子、支气管肺泡灌洗液
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50～90
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>90
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