经限制性酶酶切的DNA片段或基因,不能直接进入宿主细胞进行克隆的。一个DNA片段只有与适合的载体(vector)DNA链接构成重组DNA分子,才能进入宿主细胞(host cell),并在其中复制、扩增,克隆出多个拷贝。
①具复制原点(ori),在宿主细胞中不仅能独立地自我复制,而且能带动携带的外源DNA片段一起复制。 ②具有多个克隆位点(multiple cloning site,MCS,或称polylinker region),即具有多种限制性酶的切点,而每一种酶的切点只有一个,用于克隆外源DNA 片段。这些酶切位点不存在于复制原点或抗性选择标记基因内,以保持载体的自主复制特性及表型标记性状。 ③至少具有一个选择标记基因,这个基因通常是抗菌素的抗性基因或某种酶的基因,而宿主细胞则没有这种基因,使有或无载体的宿主细胞具有易鉴别的表型。 ④易从宿主细胞中吸收。 ㈠细菌质粒 现在广泛使用且商品化的质粒,很多都具有重组表型检测标记,在DNA克隆中根据宿主细胞的表型即可推知质粒是否携带外源DNA片段。例如pUC18质粒(图9-3)就具有以下特点:①分子量小(2.69kb),也可以接受较大的外源片段。②拷贝数多,在每个宿主细胞的拷贝数可达500个;③多克隆位点的酶切位点多,克隆方便;④具有α-互补显色表型,可作为检测重组质粒存在于否的选择标记。 α-互补是指来自细菌DNA的lacZ酶(β-半乳糖苷酶)N端的一段氨基酸残基(α-肽),在与α-肽缺失的酶混合后(体外或体内),能恢复lacZ酶的活性的一种基因内互补现象。pUC系列的载体就是利用这一特点而设计的。如图9-3所示, pUC18质粒带有细菌DNA lacZ基因启动子,操纵子,调节基因以及lacZ 基因α-肽(N端的146个氨基酸),在lacZ 基因内插入了一个多克隆位点,这段序列与lacZ在同一个阅读框架内。 pUC18表达的α-肽具有多克隆位点的18个氨基酸残基,仍具有α-互补功能。因此,将pUC18质粒转入带有lacZ 基因α-肽缺失的宿主细菌细胞内后,在含有5-溴-4-录-3-吲哚-β-半乳糖苷(5-bromo-4-chhloro-3-indoly-β-galactopyranoside,)及IPTG的培养基上,质粒产生N端的146个氨基酸,宿主菌产生C端的氨基酸,经α-互补可产生有功能的lacZ酶,水解X-gal产生一种兰色物质,附着于细菌细胞上使菌落呈兰色。当在多克隆位点插入一个外源DNA片段时,破坏了α-肽的阅读框架,或导入转录或翻译终止信号,使α-肽不能正确表达,仅宿主细菌产生的C端氨基酸没lacZ 基因有lacZ 酶活性,结果在上述同样培养条件下,形成的菌落呈白色。所以白色菌落即是带有外源DNA片段的阳性克隆。 ㈡λ噬菌体 ㈢柯斯质粒 ㈣穿梭载体 ㈤细菌人工染色体 BAC载体是基于细菌的性因子(F因子)质粒的一些特点构建的。如第6章所述,F因子是细菌细胞内能自我复制的质粒,约100kb,同时能在细菌接合时专一1000kb 的细菌染色体片段。将F因子经基因工程改良构成的BAC载体,可用于克隆100kb以上的DNA片段。带有外源片段的BAC载体在细菌细胞中通常仅单个拷贝,这一特点有利于保持DNA大分子,尤其是重复序列多的大分子,在细胞内稳定复制而不发生重组。BAC载体本身分子量小,如由小F质粒构建的载体pBeloBAC11全长7.4kb(图9-7),仅带有自我复制,控制拷贝数(repE)及质粒(parE,parA,parB)所必须的最少序列。这些基因均来自F因子。BAC载体还具有氯霉素抗性选择基因以及多克隆位点。在pBeloBAC11中,多克隆位点lacZ基因内,因此可采用选择pUC18阳性重组子的方法,即α-互补显色法选择阳性BAC重组子。此外,在多克隆位点两侧,还有T7及SP6启动子位点,用于制备RNA分子,进一步分析克隆的基因表达,作为染色体步行的探针,以及序列测定克隆的片段。 ㈥酵母人工染色体 目前应用最多的YAC载体是PYAC4(图9·8),这个载体具有以下主要结构:①两个可在酵母菌中利用的选择基因,URA3和TRP1(色氨酸合成基因);②酵母菌着丝粒序列 (centromere4,CEN4);③一个自主复制序列(ARS1); ④两个来自嗜热四膜虫 (Tetrahymenna thermophilp)的末端重复序列 (TEL),以保持重组YAC为线状结构;⑤在两个末端序列中间,有一段填充序列(stuff, HIS3),以便PYAC4在细菌细胞中稳定扩增;⑥Amp抗性及细菌质粒复制原点;⑦一个EcoR Ⅰ克隆位点,该位点位于酵母菌Sup4 tRNA基因内。Sup4 基因编码赭色抑制tRNATYR,抑制赭色表型 (成为白色)。如果用不含外源DNA片段的PYAC4载体转化酵母菌,转化子的菌落呈白色。而带有插入的外源DNA片段的PYAC4重组载体,其Sup4已经失活,结果转化酵母菌后所产生的转化子形成赭色菌落。这种插入失活选择标记的应用,大大简化了阳性克隆工作。 在利用PYAC4载体克隆时,要将PYAC4载体线性化,分离纯化带有染色体末端序列的两个臂,同时分离纯化大分子DNA片段,连接后用于转化酵母菌感受态细胞。 [七]Ti质粒及其衍生载体应用基因工程技术改良植物性状时,需要适合于植物系统,才能将重组DNA运载到植物细胞并使目的基因表达。由Ti质粒衍生的载体,是最早成功地把外源基因导入植物细胞的植物表达载体。 (1) Ti质粒具有5个主要功能区域 (图9-9)。它们分别是T-DNA、质粒转移 (plasmid transfer)、冠瘿碱代谢 (opine catabolism)、复制原点 (oir)和毒性区域 (vir)。 (2)T-DNA中直接参与转移并整合到植物染色体上的序列,仅是T-DNA两端与其他序列交界处的25bp不完全直接重复 (imperfect direct repeat),右端的这段序列称为右界 (right border,RB),左端的序列称为左界 (left border,LB )。T-DNA内的致瘤细胞诱导根瘤细胞,由这类细胞不能再生成植株。T-DNA区域内的所有基因与转移无关,所以将致瘤基因全部缺失即卸甲(disam)后,将细菌抗生素的抗性基因或其他序列插入到这个区域,形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组。 (3)vir的毒性基因是T-DNA转移所必需的,毒性基因可以顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。 Ti质粒是约200~500kb的环状DNA分子,很难用作DNA克隆载体进行操作。 2. Ti质粒的衍生载体根据Ti质粒的特点,现已构建成以下两套质粒衍生的载体系统,广泛用作植物基因工程中的载体。 (1)双元载体 (binary vector)。这个系统具有两个质粒,一个是用于克隆外源基因片段的克隆质粒,可在大肠杆菌及根瘤土壤杆菌中复制,容易操作,并可在二者间转移,也是一种穿梭质粒。在T-DNA序列外,还有细菌选择标记基因,在T-DNA的LB至RB内有一个多克隆位点及植物选择标记基因。如Pbin 19载体,它具有原核生物的卡那霉素抗性基因 (AphI)作为细菌选择标记,真核生物的卡那霉素抗性基因(nos-NptⅡ)作为植物的选择标记,pUC19的多克隆位点及a-互补显色标记。双元载体的另一个质粒,如与Pbin 19匹配使用的Pal404质粒是非致病Ti质粒,该质粒没有T-DNA序列,具有Ti质粒的毒性基因,毒性基因表达的产物以反式调控方式控制穿梭质粒上T-DNA的转移。将两个质粒分别导人根瘤土壤杆菌后,经根瘤土壤杆菌介导,克隆质粒中的T-DNA转移到植物基因组中。 (2)共整合载体 (integrated vector)。这个系统也包括两个质粒,一个用作克隆外源基因的质粒 (如Pmon200),另一个带有毒性基因 (如Ptib6S3-SE)。与双元载体的主要区别是这两个质粒具有一段同源序列,它们在根瘤土壤杆菌中经过重组整合成一个载体,故称共整合载体。 还有另一类用于植物基因工程的载体,不经根瘤土壤杆菌介导而是在其他物理及化学方法的作用下,将外源基因导入植物细胞,并整合到植物基因组中。这种载体与乃衍生质粒不同,与酵母菌穿梭质粒的结构特点类似。它们通常也具有氨卞青霉素抗性基因,用作细菌选择标记;具有潮霉素或除草剂抗性基因用作植物选择标记。这类载体如Pahc25主要用于将外源基因导入单子叶植物细胞 |
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