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植物组织培养教学设计
一、灭菌 灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者首先要清楚有菌和无菌的范畴。有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。依此观点，无菌室等未经处理的地方、超净台表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表，如整个消化道、呼吸道，即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都是有菌的。 常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施。化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。 1．培养基用湿热灭菌? 培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。 关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时,开始计时，维持压力0.1～0.15MPa 20分钟。 2. 用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌 3．植物材料表面用消毒剂灭菌 从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基，便会造成培养基污染。因此植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。接种的植物材料叫做外植体。 首先，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗，硬的材料用刮刀刮。把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放入为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。 洗时可加入洗衣粉清洗，浓度可按100ml 水加半角匙洗衣粉为宜，大约浸洗5分钟，然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。当然，最理想的清洗物质是表面活性物质－吐温。 第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒精浸10-30秒。它具有使植物材料表面被浸湿的作用。70%酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，以及主要取用内部的材料，也可只用70%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。 第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取1～2 种使用。 表4－2 常用灭菌剂使用浓度及效果比较表
上述灭菌剂应在使用前临时配制，氯化汞可短期内贮用。次氯酸钠和次氯酸钙都是利用分解产生氯气来杀菌，故灭菌时用广口瓶加盖较好；升汞是由重金属汞离子来达到灭菌的；过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌的，这种药剂残留的影响较小，灭菌后用无菌水涮洗3～4次即可；而用升汞液灭菌的材料，因升汞残毒较难去除，应当用无菌水涮洗8～10次，每次不少于3分钟，以尽量去除残毒。 灭菌时，把沥干的植物材料转放到烧杯或其它器皿中，记好时间，倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底。在快到时间之前1～2分钟，开始把消毒液倾入一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，倾净后立即倒入无菌水，轻搅涮洗。灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。记录时间还便于比较消毒效果，以便改正。灭菌液要充分浸没材料，宁可多用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏小的容器中灭菌很多材料。 二、无菌操作 接种时由于有一个敞口的过程，所以是极易引起污染的时期，这一时期主要由空气中的细菌和工作人员本身引起，接种室要严格进行空间消毒。接种室内保持定期用1-3%的高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行擦洗。除了使用前用紫外线和甲醛灭菌外，还可在使用期间用70%的酒精或3%的来苏儿喷雾，使空气中灰尘迅速沉降。工作人员进入接种室前双手必须进行消毒，先用水和肥皂洗涤，操作前再用70%酒精擦试，操作时双手不能随便接触未经消毒的东西。入室前穿好灭过菌的专用实验服，专用实验服要经常保持清洁并消毒 。头发带的灰尘也很多，因此应戴上实验用帽。工作人员的呼吸也是污染的主要途径，操作规程过程禁止不必要的谈话和咳嗽。还要尽量减少工作人员在接种室内的走动。 操作期间,尽量把所用的器皿盖子盖好。刀、剪、镊子等用具，一般在使用前浸泡在７０％的酒精中，用时再在火焰上消毒，待冷却后使用。每次使用前均需进行用具消毒。工作结束，及时取出接种材料，然后清理台面，再用５％的来苏儿或石炭酸全面喷雾或打开紫外线照射半小时。 三、接种 接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块，放入培养基的过程。以上已叙述接种前的材料表面的消毒灭菌，现将接种前后的程序连贯地介绍一遍。 (一)将初步洗涤及切割的材料放入烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗．最后沥去水分，取出放置在灭过菌的４层纱布上或滤纸上。 （二）材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材料进行适当的切割。如叶片切成0.5cm见方的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1～2片幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。 （三）用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。具体操作是：先解开包口纸，将试管几乎水平拿着，试管口靠近酒精灯焰，将管口在火焰上方转动，让管口里外灼烧数秒钟，若用棉塞盖口，可先在管口外面灼烧，去掉棉塞，再烧管口里面。然后用镊子夹取一块外植体送入试管内，轻轻插入培养基上。若是叶片直接附在培养基上，以放1～3块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放（尖端向上）其它尚无统一要求。放置材料数量现在倾向少放，人们通过统计认为：对外植体每次接种以一支试管放一枚组块为宜，这样节约培养基和人力，一旦培养物污染可以抛弃。接完种后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟。若用棉塞，塞好后，包上包口纸，包口纸里面也要过火。 四、培养 指把培养材料放在培养室（有光照、温度条件）里，使之生长，分裂、分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。
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