原生质体培养

原生质体培养

原生质体（protoplast）是去除细胞壁的裸露植物细胞。Klercker在1892年第一次尝试用利刃对细胞进行机械切割而获得原生质体，产量和效率都很低。1960年，Cocking采用真菌培养物中的纤维素酶来降解番茄根细胞壁，获得原生质体。Takebe等（1971）首次获得烟草叶肉原生质体培养的再生植株。在20世纪80年代中叶，先后从水稻和油菜原生质体培养出再生植株。原生质体培养的研究成功，不仅是生命活动理论研究的一个良好体系，还可改良作为的某些性状，潜力巨大。

       原生质体培养再生植株技术是细胞融合（cell fusion）、体细胞杂交（somatic cell hybridization）的基础。体细胞杂交能使有性过程不能杂交的亲本之间进行遗传物质重组，在农作物育种上有广阔的应用前景。

       近一二十年来，原生质体培养取得了可喜的成果。据统计，1993年有分属于49个科、146个属的320多种植物，经原生质体培养得到了再生植株。其趋势主要是农作物和经济植物，但从一年生扩展到多年生，从草本到木本、从高度植物到低等植物，如食用菌、藻类等。原生质体培养目前已成为体细胞遗传学、遗传工程和改良作物品种等方面的新途径。

      一、设备与用具：植物原生质体培养是在植物组织培养的基础上建立的一门技术。因此，除了需要组织培养的设备与用具之外，还需要一些专门的仪器和用具：

      （一）倒置显微镜、荧光显微镜及照相设备，检查原生质体或细胞培养密度，采用血球计数板，在普通显微镜或倒置显微镜下观察。观察培养皿、培养瓶或三角瓶中的培养物需用倒置显微镜。检查原生质体活性及去壁情况时，用荧光染料染色后在荧光显微镜下观察。显微镜一般都应备有显微照相设备，记录原生质体和细胞的生长状态。

      （二）细菌过滤器，酶液不能高温高压灭菌，因为高温高压会使酶钝化破坏。如果溶液中含有易被高温、高压破坏的物质时，必须用细菌过滤器过滤灭菌。一般用0.45um的滤膜可以滤去细菌和病毒。可用抽滤瓶接真空泵抽滤灭菌，也可用注射器推压过滤灭菌。

      （三）离心机，分离提纯原生质体用500r/min离心3－5min，制备酶液用2500 r/min离心10min以除去残渣。

        二、化学试剂

      （一）无机化学试剂，与组织培养的无机化学试剂基本相同，一般要求使用分析纯试剂。

      （二）有机化学试剂，用于原生质体培养的有机化学试剂有5种：

       1. 维生素，除了组织培养常用的维生素之外，有时还加入泛酸钙（维生素B5）、叶酸、维生素A、维生素C、维生素D、氯化胆碱、对甲基苯甲酸等、值得注意的是，配制母液时，应先制备各个组分的贮液。叶酸应配制低浓度贮液，先溶于少量稀碱水中，加双蒸水定容即成贮液。

      2. 激素<BR>与组织培养的基本相同，注意生长素类和细胞分裂素类的适当搭配。

      3. 渗透压稳定剂，为了使原生质体维持在一定的渗透压下，既不涨破，又不因过度收缩而破坏内部结构，必须在酶液中加入渗透压稳定剂。常用的渗透压稳定剂是糖醇系统，包括甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。目前大多数使用甘露醇或山梨醇，它们能稳定的维持渗透浓度。浓度一般为0.4-0.8mmol•L－1。蔗糖等易被原生质体吸收利用，降低渗透浓度。

      4. 碳源和氮源，原生质体也和植物细胞一样，不能自养生长，必须在培养基中加入碳源。最常用的碳源是葡萄糖和蔗糖。水解酪蛋白、谷氨酰胺、甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸等都可作为有机氮源。

     （三）凝胶剂，除了使用琼脂粉外，还有琼脂糖和一些国外的同类产品，如日本的Gellan Gum。

       三、酶类，植物细胞壁由纤维素、半纤维素和果胶三种主要成分构成。一般认为，纤维素酶和果胶酶是分离原生质体必不可少的，有些材料还需要加入半纤维素酶。最常用的纤维素酶有日本队Cellulase Onzuka R-10，Cellulase Onzuka RS，美国的Cellulysin等；果胶酶有日本的Pectolyase Y23，Macerozyme和美国的Pectinase等。

四、原生质体的分离与纯化
   （一）外植体的选择,要获得高质量的原生质体，应选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。植物的年龄、季节、光照、肥水条件等都明显影响原生质体的质量。普遍采用的外植体有限、下胚轴、幼叶、子叶等，生长在温室里的植株较好。不少人采用叶肉细胞分离原生质体，其优点是来源方便，供应及时，有明显的叶绿体，也便于在融合中认识。禾本科植物中，常采用悬浮细胞作为分离原生质体的材料。最适宜的细胞是处于对数生长早期的细胞。在酶解游离原生质体之前对植株进行预处理，有时可提高原生质体培养中的分离频率。预处理的方式有暗处理、低温处理或预先在组织培养的培养基上进行预培养。
   （二）外植体灭菌,与组织培养中的外植体灭菌相同。
   （三）酶解处理,不同植物对不同酶类的浓度是不同的。表14-1是常用的酶类和浓度，可供参考。对茄科、豆科等的幼叶来说，需要较低浓度，0.5％-1.0％纤维素酶就够了；而果胶酶可更低些（0.2％-0.5％），但是对愈伤组织、悬浮细胞、冠瘿细胞来说，纤维素酶、果胶酶的浓度要提高到1％或2％。现举几种材料的酶液全部成分如下表14－2所示。

表14－1 不同植物原生质体所用酶的种类及浓度（％）

酶种类	豇豆	烟属	洋地黄	冠瘿瘤	甘蔗	小麦	大白菜
果胶酶（ macerozyme R-10 ）	0.2	0.2	0.2	0.6		0.6	0.2
Pectolyase Y － 23					0.05
纤维素酶（ Onozuka R-10 ）	1.0	0.5	1.0	2			0.5
纤维素酶（ Driselase ）							0.2
纤维素酶（ Panda EA 3 867 ）					2	2
CaCl 2 ·2H 2 O （ mmol·L -1 ）	10	10	10	10	10	10	10
KH 2 PO 4 （ mmol·L -1 ）	0.7	0.7	0.7	0.7	0.7	0.7	0.7
MES					0.5
甘露醇 （ mmol·L -1 ）	0.5	0.6	0.55	0.5	0.4	0.5	0.6
pH 值	5.6	5.6	5.6	5.6	5.6	5.6	5.6

表 14 － 2 几种酶液的组成成分

材料	酶液成分
小麦悬浮细胞	CaCl 2 ·2H 2 O 1470mg·L -1 ， KH 2 PO 4 95mg·L -1 ， MES 600mg·L -1 ， 甘露醇 0.5mol·L -1 ， pH 值 5.6
水稻悬浮细胞	CaCl 2 ·2H 2 O 1470mg·L -1 ， KH 2 PO 4 95mg·L -1 ， MES 600mg·L -1 ， 甘露醇 0.4mol·L -1 ， pH 值 5.6 Onozuka R － 10 1 ％， Onozuka RS 0.5 ％，离析酶 R － 10 1 ％， Pectolyase Y23 0.1 ％
玉米悬浮细胞	CaCl 2 ·2H 2 O 1470mg·L -1 ， KH 2 PO 4 95mg·L -1 ， MES 600mg·L -1 ， 甘露醇 0.5mol·L -1 ， pH 值 5.6 Onozuka RS 3 ％，离析酶 R － 10 0.5 ％， Pectolyase Y23 0.1 ％，半纤维素酶 0.5 ％
哈密瓜子叶	CaCl 2 ·2H 2 O 1470mg·L -1 ， KH 2 PO 4 95mg·L -1 ， MES 600mg·L -1 ， 甘露醇 0.4mol·L -1 ， pH 值 5.6 Onozuka R － 10 1 ％，离析酶 R － 10 1 ％

      酶解处理一般静置在黑暗中进行，也可偶尔轻摇，较难分离时，可置于摇床上低速振荡。酶解时间因材料而不同，几小时到十几小时不等，但不宜超过24小时。酶解温度一般为25-27℃。
    （四）原生质体的收集和纯化
酶解处理后得到混合液包括原生质体、细胞团和组织碎片等，必须将杂质和酶液除去，才可以继续培养。收集和纯化方法大致是：用40-100um的滤网过滤混合液，去除杂质，收集滤液。将滤液以台式离心机75-100g离心3-5min，弃去上清液，沉淀物可采用下列两种方法之一进一步纯化：
      1. 沉淀物重新悬浮于清洗培养基（不含酶，其它成分同酶液）中，在50g下离心3-5min后再悬浮，如此反复洗涤2-3次。
       2. 为了纯化出有生活力的原生质体，将沉淀悬浮于少量清洗培养基，置于含有蔗糖溶液（21％）的上部，在100g下离心5-10min后，在蔗糖溶液和原生质体悬浮培养基的界面上会出现一个纯净的原生质体带，小心将此吸出后，再反复洗涤2次，最后用原生质体培养基洗一次。用Percoll或Ficoll（Sigma产品）进行纯化效果更佳。
将纯化后的原生质体调整到细胞密度为2×105个/ml，进行继后的培养。在原生质体培养之前，常常先对原生质体的活性进行检测。常用的方法有观察胞质环流、荧光素双醋酸酯（FAD）染色等方法。

五、原生质体培养
（一）培养基
原生质体的培养和组织、细胞培养相似。由于除去了细胞壁，培养基中必须有一定浓度的渗透压稳定剂来保持原生质体的稳定。原生质体培养基有多种。李向辉等（1982）建立一种能广泛适用的D2a植物原生质体培养基，适用于茄科、玄参科、豆科、藜科等植物。当再生细胞形成细胞系后进入旺盛分裂时，除去葡萄糖并及时补充蔗糖，即形成D2b培养基（表14-3）。此外，高国楠等（Kaoetal，1977）提出的KM-8P培养基和B5培养基等对某些植物也行之有效，一般来说，无机盐的大量元素含量稍低，钙离子浓度较高，采用有机氮源而少用铵盐。在培养基中添加天然有机物质如椰汁、酵母提取物等对原生质体的生长有利。不同的植物对激素的种类和浓度要求不同。常采用1－2 mg•L-12，4－D或配以低浓度（0.2-0.5 mg•L-1）的玉米素。
表14-3 原生质体D2a和D2b培养基的成分

矿物盐	用量 / mg·L -1	有机成分	用量 / mg·L -1
			D 2a	D 2b
NH 4 NO 3	270	间－肌醇	100	100
KNO 3	1480	烟酸	4.0	4.0
CaCl 2 ·2H 2 O	900	硫胺素－ HCl	4.0	4.0
MgSO 4 ·7H 2 O	900	甘氨酸	1.4	1.4
KH 2 PO 4	80	吡哆素－ HCl	0.7	0.7
FeSO 4 ·7H 2 O	27.8	叶酸	0.4	0.4
Na 2 － EDTA	37.3	生物素	0.04	0.04
H 3 BO 3	2.0	NAA	1.5	1.5
MnSO 4 ·4H 2 O	5.0	6 － BAP	0.6	0.6
ZnSO 4 ·7H 2 O	1.5	椰汁	5 ％	5 ％
KI	0.25	2 ， 4 ， 5 － T	0.5
Na 2 MoO 4 ·2H 2 O	0.10	葡萄糖	0.4 mol·L -1
CuSO 4 ·5H 2 O	0.015	蔗糖	0.05 mol·L -1	0.06mol·L -1
CoCl 2 ·6H 2 O	0.01	琼脂		4000
pH 值＝ 5.8

（二）培养方法
原生质体的培养方法有液体培养、固体培养和固液混合培养等三种。①液体培养又可分为微滴培养和浅层培养两种。微滴培养是将悬浮的密度为每毫升104-105个原生质体的培养液用滴管以0.1ml左右的小滴一滴一滴的接种到培养皿上，由于表面张力的作用，小滴以半球形保持在培养皿表面，如果将培养皿翻转过来，则成为悬滴培养。微滴培养的优点是如果其中一滴或几滴发生污染，不会殃及整个实验。缺点是原生质体分布不均匀，集中在小滴中央，且与空气接触面大，液体容易蒸发，使培养基浓度提高。液体浅层培养是一种有效方法，将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层。液层不要太厚，以免通气不良而导致原生质体不易分裂。②固体培养是将悬浮在液体培养基中的原生质体悬液与热融的含琼脂的培养基在一定的温度（45℃）下等量混合。琼脂冷却固定后，原生质体就埋在培养基内培养。用琼脂糖代替琼脂可提高植板效率，特别是对一些不容易发生分裂的原生质体。这种方法的优点是可以在倒置显微镜下定点的观察一个原生质体的分裂情况；缺点是只有在固体表面的原生质体才能分裂，埋在琼脂内部的因通气不良而不分裂。③固液混合培养是在培养皿底部先铺上一层琼脂培养基，待固化以后，在固体培养基表面再作浅层液体培养。
（三）培养条件
1. 保持湿度是培养的关键因子。因为培养基的用量很少，水分稍为蒸发就会引起渗透压提高，原生质体就受影响。因此培养皿必须严密封住，并放在能保持湿度的容器内。
2. 各种植物原生质体要求不同的最适温度，一般可在25℃上下。在光照方面，多数原生质体适合在暗淡的散射光下或黑暗中生长。
3. 原生质体培养要求有较高的密度，具体密度因植物材料、物种及基因型不同而异。一般培养密度是104-105个/ml，太密太疏都不好。例如大豆子叶原生质体培养最适密度是1×105个/ml左右，当密度达到5×105个/ml时，原生质体分裂明显受抑制，逐渐破碎解体；但密度较低时（0.5×105个/ml），不利于快速得到愈伤组织。
4. 原生质体培养了一段时间后，要添加新鲜培养基，并且逐步用较低渗透压的细胞培养基代替，以便适应新细胞团或愈伤组织的生长。
（四）原生质体的发育
原生质体在适合的条件下，首先形成新的细胞壁，继而进行分裂，形成愈伤组织。
茄科植物如烟草、矮牵牛等叶肉细胞原生质体在D2a培养基上首先增大体积，叶绿体重排于细胞核周围，在短时间合成新细胞壁，细胞由球形变成长椭圆形。在1-2天内便形成完整的细胞壁。新形成的细胞壁可用质壁分离显示，或用荧光染料显示。
如果培养基合适，培养2-3天后胞质增加，RNA、蛋白质及多聚糖合成增加，不久即发生核的有丝分裂和胞质分裂，形成细胞团或愈伤组织。第一次细胞分裂的时间因植物材料和培养条件而定，大约是培养后2-10天。虽然细胞有分裂能力，但不一定能继续分裂下去。例如茄科和豆科等植物能不断分裂，而禾本科的小麦叶肉原生质体只能分裂2-3次，大麦也只能分裂5-6次。
虽然每个原生质体都有再生分裂的潜在能力，但在培养基中只有一部分能分裂。除植物种类基因型外，还主要取决于培养基的培养条件。烟草叶肉原生质体在NT培养基上培养一周，分裂频率（植板率）为54.9％，如在2N-11培养基上培养同样时间，则可达82.8％。待小愈伤组织长至1mm左右时，及时将其转入固体培养基上使其进一步生长。培养基组成一般与愈伤组织培养基相同。
（五）原生质体植株再生
原生质体分化为再生植株通过两种途径：一种途径是将原生质体再生的愈伤组织直接转移到分化培养基上，一步成苗。关键是选择适合的培养基并调节生长素和激动素的平衡。另一种途径是由先将愈伤组织培养在含细胞分裂素（一般为0.5-2.0 mg•L-1）和低浓度2，4-D（一般为0.02-0.2 mg•L-1）的分化培养基上，形成质地较硬的胚性愈伤组织或胚状体，再将其转到含细胞分裂素的分化培养基上再生植株。