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免疫酶组化技术是用酶标记抗体通过显色反应检测细胞和组织内的抗原，从而达到诊断和研究疫病的目的。抗原的准确显示和定位与制备的细胞和组织标本质量的好坏有着密切的联系。由于各种抗原的生化、物理性质不同，免疫学活性可受到温度高低、酸碱度强弱及各种化学试剂作用的影响，良好的细胞和组织学结构将有助于抗原的准确定位。因此，细胞和组织标本的采集、制备在免疫组化技术中占有十分重要的位置。
（一）细胞标本的取材
1.印片法 主要应用于活组织检查标本和剖检取材标本。新鲜标本做剖面，充分暴露病变区，将载玻片轻轻压于病变区，脱落的细胞便粘附在玻片上，立即浸入细胞固定液内 5~10min ，取出后自然干燥，低温保存备用。
其优点是简便省时，细胞抗原保存较好；缺点是细胞分布不均匀，玻片上细胞重叠，影响标记效果。
2.涂片法 将培养细胞制成 2 × 106 个细胞 /mL 的细胞悬液，用细胞离心涂片器或注射针头式滴管涂布于载玻片上，自然干燥，固定液固定，低温保存备用。
对有贴壁生长特性的细胞可将盖玻片直接置于培养液内，即可得到理想的细胞标本，取出后 PBS 清洗、固定、 4 ℃ 保存备用。
如待检物为组织液、分泌物、血液等，可在载玻片上做涂片，固定后 4 ℃ 保存备用。
（二）组织标本的取材
为避免组织自溶造成的抗原性消失、弥散现象，应尽快固定处理。取材时要注意：
1.取材部位应是主要病变区；
2.必须取病灶与正常组织交界区；
3.必要时取远离病灶区的正常组织做对照。
（三）细胞和组织的固定
1 、 固定
为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。
2 、 固定剂
用于免疫组化的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其要重视固定剂的选择。
醛类固定剂 双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。对 IgM 、 IgA 、 J 链、 k 链和 λ 链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。
（ 1 ） 10% 中性缓冲福尔马林（甲醛原液 10mL ， 0.01moL/L pH7.4 PBS 90mL ）。
（ 2 ） 10% 钙 - 福尔马林（甲醛原液 10mL ，饱合碳酸钙 90mL ）。
（ 3 ） 10% 多聚甲醛磷酸缓冲液（多聚甲醛 40g ， 0.1moL/L pH7.4 PBS 500mL ，两者混合加热至 60 ℃ ，搅拌并滴加 1N NaOH 至清晰为止，冷却后加 PBS 液至总量 1000mL 。
丙酮及醇类固定剂 是最早使用的免疫组化染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性强，保存抗原的免疫活性较好，但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞质内蛋白质的保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。
（ 1 ）丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原较好，平时 4 ℃ 低温保存备用，临用时，只需将涂片插入冷丙酮内 5~10min ，取出后自然干燥，低温冰箱保存备用。
（ 2 ） Clarke 改良固定剂（ 100% 乙醇 95mL ，冰醋酸 mL ），用于冰冻切片的后固定。
（ 3 ）乙醚（或氯仿）与乙醇等量混合液。对组织穿透性极强，即使涂片上含较多的粘液，固定效果仍较好，是理想的细胞固定液。
（ 4 ） AAF 液（ 95%~100% 乙醇 85mL 冰醋酸 5mL ，浓甲醛 10mL ）。
用于免疫组化的固定剂种类很多，不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液。迄今为止，尚无一种标准固定液可用于各种不同的抗原固定，选择最佳固定液的标准是：
① 能最好地保持细胞和组织的形态结构；
② 最大限度地保存抗原的免疫活性。
一些含重金属的固定液在免疫组化技术中是禁用的。实际工作中，中性福尔马林（或多聚甲醛）是适应性较广泛的固定液，但固定时间不宜过长。必要时，可作多种固定液对比，从中选出理想的固定液。
3 、 组织固定时应注意：
（ 1 ）应尽快固定处理要取材的组织，力求保持组织新鲜，不干燥。
（ 2 ）组织块不要过大过厚，尤其厚度不要超过 1cm 。
（ 3 ）固定液量要充足，一般要 20 倍于组织的量，量太少会造成固定液浓度降低。
（ 4 ）组织固定后应充分水洗，去除固定液，以减少固定液造成的人为假象。固定时间最好以完全浸透为宜（ 12h~72h ），固定时间过久可能会影响染色效果。
（四）组织的脱水、透明、浸蜡
做石蜡切片的组织需经固定、脱水、透明、浸蜡和石蜡包埋，才能制备出薄片。整个操作过程中要掌握的原则是：脱水透明要够而不过，浸蜡的温度不宜超过 64 ℃ ，否则一是可能使抗原活性下降，降低检出率，另外还可能造成组织焦脆，焦脆的组织切片困难，即使勉强切下来了，染色过程中也极易脱片，且染色效果不好。具体程序如下：
组织脱水、透明、浸蜡程序
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液缸号
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液体种类
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处理时间
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处理温度
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脱
水
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1
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70%酒精
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2小时
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室温
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2
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80%酒精
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2小时
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室温
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3
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90%酒精
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2小时
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室温
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4
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无水酒精
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2小时
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室温
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5
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无水酒精
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2小时
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室温
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6
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无水酒精
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3小时
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室温
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7
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无水酒精
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3小时
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室温
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透
明
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8
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二甲苯或氯仿
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1小时
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室温
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9
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二甲苯或氯仿
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1小时
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室温
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10
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二甲苯或氯仿
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1小时
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室温
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浸
蜡
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11
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石蜡
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30分
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60℃
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12
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石蜡
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30分
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60℃
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13
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石蜡
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30分
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60℃
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14
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石蜡
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30分
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60℃
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从蜡缸拿出后用石蜡进行包埋。
（五）切片
1.载玻片的预处理 载玻片的处理是做好免疫组化染色的重要步骤，尤其对一些需做酶消化、微波或高压处理、 PCR 扩增的组织切片更为重要，目前常用的防脱片剂有以下几种：
（ 1 ） APES （ 3- 氨丙基三乙氧硅烷） 它可以和组织、玻片上的氢键形成共价键。用甲醇 / 丙酮配成 2% 浓度使用。 APES 使用方便，便于大量应用，且价格便宜。
（ 2 ） 1% 铬明矾明胶
（ 3 ）白胶
（ 4 ）多聚左旋赖氨酸 粘贴较紧，可用于多种组织化学、原位核酸分子杂交等。但其价格较贵。
2.切片
用石蜡切片机将包埋有组织的蜡块切成薄片，切片厚度一般 3—5μm ，除脑组织等细胞量较少的组织外，切片要尽可能薄， 45 ℃ 水温展片，要尽量展平，否则皱褶处易出现非特异染色。 55~60 ℃ 温箱烤片 2 小时，防水密封，低温保存备用。
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